陆健昇
- 作品数：5 被引量：7H指数：1
- 供职机构：军事医学科学院生物工程研究所更多>>
- 发文基金：国家科技重大专项更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- HBx-EGFP-TLM融合蛋白表达载体的构建、蛋白表达纯化及活性检测
- 2011年
- 乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)具有广泛的转录激活作用,但是由于细胞类型和实验条件的差异,外源启动子介导的HBx瞬时表达水平常表现出不均一性,为其功能的研究带来困难。为了解决HBx研究过程中遇到的这些难题,利用PCR扩增获得HBx及含转导肽TLM的EGFP编码序列,经酶切后插入pGEX-4T-1原核表达载体,成功构建重组质粒pGEX-HBx-EGFP-TLM和pGEX-EGFP-TLM。重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,融合蛋白经IPTG诱导表达,采用?KTATM Purifier蛋白纯化系统纯化并进行SDS-PAGE和Western blotting分析,确定为目的蛋白。将纯化后的融合蛋白分别与AML12和SMMC-7721细胞共孵育,Western blotting和激光共聚焦显微镜检测证实TLM转导肽能够介导HBx-EGFP和EGFP进入细胞,同时进入细胞的HBx-EGFP-TLM能够发挥转录激活活性,为HBx功能的深入研究奠定了基础。
- 史晓燕张莹莹周晓巍陆健昇郭泽坤黄培堂
- 关键词：乙型肝炎病毒乙型肝炎病毒X蛋白
- 利用线性表达框高通量表达人源单克隆抗体被引量：1
- 2016年
- 目的:建立不通过克隆步骤高通量表达来源于人单个B细胞的抗体轻、重链基因的方法。方法和结果:PCR扩增3个末端重叠的DNA片段,即1CMV启动子和编码抗体引导区序列的片段;2抗体Ig G1重链恒定区序列和牛生长激素(BGH)poly(A)信号序列,轻链Igκ恒定区序列和BGH poly(A)信号序列,轻链Igλ恒定区序列和BGH poly(A)信号序列;以及3抗体基因可变区序列V_H、V_κ或V_λ。3个片段通过重叠延伸PCR构建全长线性片段即线性表达框,将此来源于人单个B细胞的配对的抗体轻、重链线性表达框共转染293E细胞,72 h收集上清检测到表达的抗体。结论:构建的抗体基因线性表达框是无须克隆,快速高通量表达抗体基因进行筛选分析的策略。
- 张梦雄杨志新王荣陆健昇夏炳辉周晓巍黄培堂
- 关键词：单克隆抗体抗体基因重叠延伸PCR
- 应用HA、NA、M1和M2蛋白制备H5N1高致病性禽流感病毒样颗粒被引量：5
- 2011年
- 目的:应用重组杆状病毒表达系统制备由HA、NA、M1和M2蛋白组成的H5N1高致病性禽流感病毒样颗粒,为研究H5N1高致病性禽流感疫苗奠定基础。方法:构建能共表达A/chicken/Jilin/2003(H5N1)禽流感病毒血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)、A/PR/8/34(H1N1)流感病毒基质蛋白(M1)和离子通道蛋白(M2)的2个二元重组杆状病毒,共同感染HighFive细胞,同时表达HA、NA、M1和M2蛋白,使这4种蛋白在感染的细胞内自主组装成病毒样颗粒。经差速离心和蔗糖密度梯度超速离心收获病毒样颗粒,通过Western印迹鉴定病毒样颗粒的组成,透射电镜观察病毒样颗粒形态,血凝试验测定病毒样颗粒的活性。结果:HA、NA、M1、M2蛋白在昆虫细胞中共表达,并组装成病毒样颗粒;电镜观察到病毒样颗粒的形态与流感病毒一致,直径约80 nm;血凝试验显示该病毒样颗粒具有凝集鸡红细胞的活性。结论:应用该方法可以制备流感病毒样颗粒,为H5N1流感疫苗研究提供了可行方案。
- 王立强许龙周晓巍杨志新陆健昇刘冰夏炳辉杨津黄培堂
- 关键词：流感病毒病毒样颗粒杆状病毒
- 不同基因型HBx对乙型肝炎病毒复制的影响被引量：1
- 2011年
- 目的探讨A、B、C和D四个基因型乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis Bvirus Xprotein,HBx)对乙型肝炎病毒(hepatitis Bvirus,HBV)复制的影响。方法构建含A、B、C和D四种基因型HBx的真核表达载体和提前终止HBx表达的突变型单倍体HBV表达系统,共转染至人肝肿瘤细胞系HepG2细胞,利用荧光素酶报告系统检测不同基因型HBx对HBV核心启动子的激活作用,利用酶联免疫法(ELISA)检测培养上清中HBV表面抗原(HBsAg)和e抗原(HBeAg)的表达情况,利用特异性引物PCR方法检测细胞中HBV前基因组RNA(pgRNA)和总RNA(pgRNA,2.2kb和0.8kbRNA)的转录情况。结果 A、B、C和D四种基因型HBx的表达均可显著激活HBV核心启动子活性,但不同基因型HBx的激活作用不同。除C基因型外,A、B和D三种基因型HBx均可显著增强HBsAg和HBeAg的胞外分泌水平。检测HBV复制中间产物发现,C基因型HBx对HBVpgRNA和总RNA转录水平的影响显著低于A、B和D基因型。结论不同基因型HBx对HBV复制的影响不同,为进一步研究HBV基因型与HBV复制能力以及临床病理表现的关系打下基础。
- 张莹莹史晓燕陆健昇周晓巍黄培堂
- 关键词：乙型肝炎病毒X蛋白病毒复制基因型
- 抗鼠疫菌保护性抗原V抗体的筛选与鉴定
- 2022年
- 目的构建纳米抗体噬菌体展示库,筛选抗鼠疫菌中和抗体,为鼠疫防治药物研制奠定基础。方法重组鼠疫菌保护性抗原V蛋白免疫双峰驼,分离外周血单核细胞,提取RNA,构建纳米抗体噬菌体展示库。以V蛋白为抗原对抗体库进行3轮固相筛选,挑选单克隆phage-ELISA鉴定,然后将富集的纳米抗体进行表达、纯化及评价。结果成功构建了库容量为1.9×10^(8)的抗鼠疫菌V蛋白纳米抗体噬菌体展示库。经过3轮筛选,获得8种抗体序列,表达和纯化后经ELISA检测,8株纳米抗体针对鼠疫菌V蛋白特异性良好且结合活性高。动物实验表明其中一株纳米抗体VHH-hFc6对鼠疫菌201株气溶胶攻击的保护率为33%。结论成功构建了抗鼠疫菌保护性抗原V蛋白的纳米抗体噬菌体展示库,筛选出8株抗V蛋白特异性纳米抗体,其中一株具有良好的中和活性。
- 谢青李志颖张卫郭家正黄莺王茜陈蕾张艺潇陆健昇杨志新
- 关键词：鼠疫菌中和抗体
