王锦之
- 作品数：7 被引量：21H指数：2
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- 相关领域：生物学化学工程医药卫生更多>>
- 一种获得目的mRNA的方法
- 本发明提供了一种获得目的mRNA的方法。该方法是将目的基因进行改造，在其3’末端引入oligo(dT)序列，然后分别在5’端和3’端加上限制性内切酶识别序列，并与载体结合，转化到大肠杆菌感受态细胞中，促使其高表达，提取大...
- 杨忠赵建龙马昱澍肖君华王锦之魏东芝
- 文献传递
- 重组HIV-TATm-Survivin(T34A)蛋白制备及其促癌细胞凋亡活性研究被引量：3
- 2006年
- 从人乳腺癌细胞系B-Cap-37中克隆出Survivin的cDNA,并对其中编码34位Thr的密码子定点突变为Ala的密码子后,经一系列基因操作方法将天然HIV-TAT转导肽的突变体基因HIV-TATm引入Survivin(T34A)基因的5′端,正确构建了表达载体pRSET-B-HIV-TATm-Survivin(T34A),经转化E.coliBL21(DE3)后诱导表达,目的蛋白质以包涵体形式表达,占菌体总蛋白的45%。经3.7L发酵罐分批发酵可收获650mg/L的包涵体,经阳离子交换、凝胶层析分离和柱上复性与透析,得到纯度达96%以上的可溶性目的蛋白HIV-TATm-Survivin(T34A)。目的蛋白对人乳腺癌细胞B-Cap-37、人胰腺癌细胞SW1990和人肝癌细胞SSMC-7721作用4h后有在细胞形态上呈现出显著的凋亡特征,而对人宫颈癌细胞系Hela不敏感,对正常的人内皮细胞系EVC-304未见明显影响。作用24h时MTT法检测显示,120μg/mL目的蛋白对SW1990、B-Cap-37、SSMC-7721和Hela细胞的抑制率分别达到89%、63%、59.5%和39%,且具有剂量依赖性。对最为敏感的SW1990和B-Cap-37以每孔60μg/mL终浓度的目的蛋白作用48h的流式细胞技术检测发现,凋亡率分别为25.6%和19.3%,与对照相比,实验组细胞出现明显的凋亡峰,细胞周期的分布发生明显的变化,65%以上的癌细胞被阻滞于G1期。体外实验结果显示重组目的蛋白具有较强的抑制癌细胞增殖和促进凋亡作用,预示着良好的抗癌前景。
- 郑文云马兴元魏东芝王锦之刘清海马昱澍杨胜利
- 关键词：表达纯化
- 抗菌肽Adenoregulin基因工程菌培养条件的优化及分批发酵研究被引量：18
- 2005年
- Adenoregulin(ADR)是来源于南美树蛙Phyllomedusabicolor皮肤的含有33个氨基酸的抗菌肽,在非极性环境中形成α_螺旋型结构,具有抗菌活性强、抗菌谱广的特点。将ADR基因克隆于pET32a载体上,转化大肠杆菌BL21(DE3),对这一工程菌株的培养条件进行了优化。通过正交试验,考察诱导时机、诱导剂量和诱导时间三个因素的不同水平对蛋白表达的影响,结果发现诱导时机的影响尤为显著,考察了9种不同培养基对表达量的影响,发现培养基中加入葡萄糖对目标蛋白的稳定表达起了重要的作用,确定最佳培养条件为:培养基为2×YT+0·5%葡萄糖,诱导时机为OD600=0·9左右,诱导剂IPTG加入的终浓度为0·1mmol/L,诱导时间为4h。采用前期恒pH、后期指数流加的策略进行工程菌BL21(DE3)/pET32a_adr的高密度培养,在整个流加过程中,通过控制葡萄糖的加入量,将菌株的比生长速率控制在0·15h-1,乙酸浓度也被控制在较低的水平(<2g/L),但是质粒丢失严重,在发酵结束时,约有40%的大肠杆菌中不带质粒,这导致了目标蛋白的表达量下降严重,但是表达的目标蛋白90%以上为可溶性形式。表达的融合蛋白无抑菌活性,而裂解后得到的ADR单体具有明显的抑菌活性。
- 周宇荀曹巍魏东芝罗清平王锦之
- 关键词：大肠杆菌
- 分泌型TAT蛋白转导结构域基因通用真核表达载体的构建及表达
- 2005年
- 目的:构建一个全新的分泌型TAT蛋白转导结构域基因哺乳动物细胞融合表达载体并对融合蛋白的表达进行分析。方法:依照编码TATPTD11肽及所引入的BamHI酶识别序列和增强性绿色荧光蛋白N端7个氨基酸的碱基序列合成了3条引物,以egfp基因为模板通过依次3轮PCR扩增得到tategfp融合基因,该基因片段以SfiI和HindⅢ双酶切后插入哺乳动物细胞表达载体pSectagA,构建成重组载体pSecTATmegfp,BamHI单酶切后该载体自连,即得到可通用的真核表达载体pSecTATm,重组质粒pSecTATmegfp转染HEK293细胞,融合蛋白的表达用Westernblot分析。结果:酶切及测序证实表达载体pSecTATm构建成功,Westernblot表明TATEGFP融合蛋白在HEK293细胞中获得表达并分泌到细胞培养液中。结论:成功地构建了分泌型TAT蛋白转导结构域基因的哺乳动物细胞融合表达载体,为更充分发挥TAT蛋白转导结构域在蛋白质功能及疾病治疗研究中的应用打下了基础。
- 王锦之陈巨星杨忠周宇荀马昱澍魏东芝
- 关键词：WESTEMBLOT
- 一种获得目的mRNA的方法
- 本发明提供了一种获得目的mRNA的方法。该方法是将目的基因进行改造，在其3’末端引入oligo(dT)序列，然后分别在5’端和3’端加上限制性内切酶识别序列，并与载体结合，转化到大肠杆菌感受态细胞中，促使其高表达，提取大...
- 杨忠赵建龙马昱澍肖君华王锦之魏东芝
- 文献传递
- 一种抗菌肽的制备方法
- 本发明涉及生物技术领域，公开了一种制备抗菌肽Adenoregulin的方法，所述方法通过化学合成目的基因，PCR进行扩增，构建重组质粒，将其转入宿主细胞，获得融合表达Adenoregulin多肽的工程菌，并发酵培养该工程...
- 周宇荀曹魏魏东芝马昱澍王锦之
- 文献传递
- B淋巴细胞刺激因子基因的克隆及在大肠杆菌中的高效表达
- 2005年
- 聚合酶链式反应(PCR)扩增获得了编码BLys(134-285AA)的cDNA片段,该片段以限制性内切酶Bgl 和Hind 双酶切插入pET32a载体。测序表明除(ATA263→ATG263)突变并导致了氨基酸(I263M)突变外,其余序列与Genbank报道的序列一致。蛋白表达用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,SDS-PAGE表明:在33ku处有明显的融合蛋白表达,其表达水平高达总菌体蛋白的50%。点印迹证实融合蛋白能与anti-His6Tag抗体反应。生物学活性研究表明BLys协同丝裂霉素能明显地抑制HeLa细胞的生长。
- 王锦之周卿周宇荀马昱澍魏东芝
- 关键词：B淋巴细胞刺激因子大肠杆菌丝裂霉素
