李俊强
- 作品数：10 被引量：27H指数：3
- 供职机构：北京大学人民医院更多>>
- 发文基金：国家科技重大专项国家自然科学基金国家重点基础研究发展计划更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 尿苷酶在丙型肝炎病毒逆转录-抗污染-联体聚合酶链反应中的应用
- 2007年
- 目的:建立丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)逆转录-抗污染-联体聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR),并优化尿苷酶(Uracil-DNA glycosylase,UDG)的抗污染剂量和抗污染时间。方法:逆转录-抗污染-联体PCR技术的第1次PCR实行逆转录-抗污染-PCR同步化;第2次PCR经分层蜡处理进行全程抗污染,并应用该技术扩增HCV cDNA,制备全含脱氧尿嘧啶核苷酸(dUTP)的DNA(dU-DNA)为模板,作为UDG实验室抗污染质控对照并验证该联体PCR检测HCV RNA灵敏度,用DNA-酶免疫测定技术检测HCV cDNA。结果:抗污染实验结果证实,0.2u的UDG在37℃和42℃40min均可达到抗污染的效果。对高浓度全dU-DNA模板也有良好的抗污染效果。灵敏度检验结果表明,用HCV RNA浓度为2.110×105copies/mL的血清,稀释到10-4倍后仍可检测出HCV RNA。结论:应用该逆转录-抗污染-联体PCR技术进行全程抗污染,减少了因程序中多次加样造成的污染,为HCV逆转录PCR(reverse transcription-PCR,RT-PCR)检测RNA提供良好的防污染和抗污染操作技术。
- 杜绍财张瑞李俊强魏来
- 关键词：尿苷肝炎病毒逆转录聚合酶链反应
- 乙型肝炎病毒rtA181V/T和rtN236T变异阿德福韦耐药株表达质粒的构建及其病毒学特征被引量：2
- 2007年
- 目的构建乙型肝炎病毒阿德福韦耐药变异株(rtA181T/V 和 rtN236T)表达载体并对其体外复制能力和耐药性等病毒学特征进行体外研究。方法以含1.2倍拷贝 HBV DNA 全基因的质粒 PUC-HBV1.2WT为模板,PCR 定点诱变技术构建含阿德福韦耐药株(rtA181V/T和 rtN236T)的目的质粒,测序验证并利用变异株特异检测引物进行 PCR 检测;转染人肝癌细胞系 HepG2,ELISA 检测上清中分泌的 HBsAg 和 HBeAg 水平,荧光定量 PCR 检测上清中病毒 DNA 水平,Southern blotting 检测胞浆 HBV 复制中间体水平,比较野生株和变异株体外复制能力和对阿德福韦敏感性的差异。结果构建的 rtA181T、rtA181V 和 rtN236T 表达质粒可用于变异株特异检测引物检测相应变异的阳性对照品;转染 HepG2细胞后均可获得高水平的病毒抗原表达,胞浆和细胞培养上清中可以检测到 HBV 复制中间体和病毒颗粒的存在;三种变异均可单独导致对阿德福韦耐药,IC_(50)为野生株的2.8至4.7倍;体外复制能力较野生株降低,分别为野生株的94.2%、89.0%和77.7%。结论成功构建乙型肝炎病毒阿德福韦变异株表达质粒并应用于变异株特异引物扩增检测技术,体外实验证实 rtA181V/T 和rtN236T 单独变异均可导致 HBV 对阿德福韦耐药,且变异株的病毒复制能力较野生株有所下降。
- 王江华李俊强蒋栋费然丛旭杜绍财魏来
- 关键词：肝炎病毒乙型阿德福韦
- 中国南部和西南地区HCV感染的基因型分布特征被引量：11
- 2007年
- 目的了解中国南部和西南地区HCV感染基因型分布特点。方法用丙型肝炎病毒(HCV)5'非编码区ABC复合酶切分型的方法,对49例广州和重庆HCV感染者进行基因分型,并对检出的6a型产物进行测序。将所得序列与GenBank参考序列比对,并作同源性分析。结果49例样品中共检出4例6a型,序列分析表明这4例样品都具有6a型特征性,即第-145位的CA插入,并与6a型参考序列同源性最高。分型结果表明,34例广州样品中,1b型25例(72.53%)、2a型5例(14.71%)、3b型1例(2.94%)、6a型2例(5.88%)、1b和2a混合型1例(2.94%);15例重庆样品中1b型8例(53.33%)、2a型1例(6.67%)、3a型1例(6.67%)、3b型3例(20.00%)、6a型2例(13.33%)。结论广州和重庆两个城市的基因型分布都以1b型为主,并首次在广州检出6a型感染,但感染率低于2a型;而重庆则为2a、3a、3b和6a型等多种基因型分布的特点,说明我国南部和西南地区HCV基因型分布与中国大陆其他地区的流行模式存在差异,这可能与其地理位置及静脉药瘾者的迅速增多有关。
- 刘丽君张瑞李俊强田园杜绍财魏来
- 关键词：肝炎病毒基因型
- 拉米夫定耐药性变异与乙型肝炎病毒基因型间的关系被引量：3
- 2006年
- 目的探讨乙型肝炎病毒(HBV)基因型与拉米夫定耐药性变异类型间的关系。方法选取95例来自本院肝炎门诊和病房的YMDD变异阳性血清样品,应用限制性内切酶MboⅠ和EarⅠ对PCR产物进行酶切分析及分型,并作遗传进化树图分析验证。结果95例样品中检出C型75例,占79%;B型20例,占21%,进化树图分析证明酶切分型法确切可靠;B型病毒的YVDD变异、YIDD变异及YMDD+YVDD+YIDD联合变异的例数分别为11例、5例和4例,而C型中则分别为35例、27例和13例,对B、C基因型与YMDD变异类型间作卡方检验,得出差异无统计学意义(χ2=0.856,P=0.710)。结论使用MboⅠ和EarⅠ酶切分型操作简单,结果可靠。HBVB型和C型病毒感染对发生不同YMDD变异类型无影响。
- 李俊强刘丽君刘峰杜绍财
- 关键词：拉米夫定抗原变异基因分型
- 乙型肝炎病毒表面抗原终止密码子的偏嗜性选择
- 2008年
- 目的:探究乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)终止密码子的存在状况及偏嗜性。方法:从GenBank中选取各基因型的参考序列共174例;使用生物软件BioEdit进行序列比对,应用RNAdraw构建并分析其RNA二级结构。结果:(1)在174例参考序列中,HBsAg的终止密码子共有TAA和TGA两种形式。其中TAA形式的有124例,占71.26%;TGA形式的有50例,占28.74%。(2)终止密码子的使用存在偏嗜性,并影响RNA的二级结构和蛋白质的编码氨基酸序列。结论:HBsAg终止密码子的使用偏嗜性客观存在,可能与进化过程中RNA结构和蛋白质功能的保守性相关。
- 李俊强田敬华刘峰杜绍财
- 关键词：肝炎病毒乙型密码子
- PCR实验加样器污染的解除方法及污染对微孔板杂交的影响被引量：3
- 2006年
- 经多年来的分子生物学实验证实尿苷酶（UDG）是当前抗污染非常有效的试剂，在国家批准的体外诊断试剂中应用UDG抗污染已程序化。随着分子生物学学科发展。聚合酶链反应已在多学科的多项研究中推广和应用。而其预防污染和抗污染研究工作依然极其重要。2000年我所曾对聚合酶链反应污染环节进行详细的分析和研究。
- 杜绍财张瑞李俊强魏来
- 关键词：防污染微孔板杂交加样器体外诊断试剂污染环节
- 中国东北部延边地区丙型肝炎病毒1a型感染研究被引量：3
- 2007年
- 目的初步探讨东北部延边地区 HCV 基因型分布和1a 型的感染状况。方法对44例来自延边地区的 HCV RNA 阳性样本进行 HCV5′非编码区(5′NCR)复合酶切分型分析。将分型结果为1a 型的4例样品(分别为 Y2、Y4、Y6、Y8)进行5′NCR 和 NS5B 区的扩增,测序,然后与27个HCV 全基因参考序列(均来自 GenBank)比对并构建遗传进化树。结果 44例样品中1a/1b 混合型19例(43.1%),1b 型12例(27.3%),2a/1b 混合型8例(18.2%),1a 型4例(9.1%),2a 型1例(2.3%),2b 型以及3～6型未检出。其中,1a 型的4例样品 Y2、Y4、Y6、Y8分别与各基因型的全基因参考序列相比较,在5′NCR 与1a 型参考序列 HC-J1的同源性最高,分别为0.990、0.990、0.990、0.990,进化树分析也证实为1a 型;在 NS5B 区与1b 型参考序列 HC-J4的同源性最高,分别为0.936、0.957、0.936、0.936,进化树分析表明为1b 型。结论延边地区以1a/1b 型混合感染为主,1b 型和1b/2a 型感染次之,与中国其他地区存在明显差异。对4例1a 型 HCV 病毒株的分析发现,存在 HCV5′NCR 与 NS5B 分型结果不一致现象。分析推测可能是 HCV 基因组在生物进化过程中自然重组的表现,但尚需进一步研究证实。
- 刘丽君张瑞李俊强杜绍财金丹魏来
- 关键词：C型肝炎样病毒属基因型
- HBV基因型与疾病的关系被引量：1
- 2006年
- 李俊强杜绍财
- 关键词：基因型肝疾病
- 慢性重型肝炎患者乙型肝炎病毒S基因区变异对其RNA二级结构的影响被引量：1
- 2007年
- 重型肝炎患者由于肝功能衰竭和机体免疫功能低下，病死率较高，但目前的相关研究主要集中在前C区变异及e抗原的存在状态对肝炎进展的影响上，关于RNA方面的研究多见于ε环变异对病毒包装的影响。我们选取慢性重型肝炎患者的血清佯本，通过扩增HBVs基因及测序，应用软件模拟构建其RNA二级结构并考察其变化，以探讨慢性重型肝炎患者血清中HBV变异的存在情况及其对疾病的影响。
- 李俊强许正锯刘峰杜绍财
- 关键词：肝炎病毒乙型碱基序列
- 丙型肝炎病毒6a型感染的状态与分析被引量：4
- 2006年
- 目的:初步探讨丙型肝炎病毒6 a型感染的状态。方法:对经HCV 5′非编码区(5′NCR)复合酶切分型结果为6 a的3例样本(95,126,150)进行5′NCR和NS5B区的扩增、测序,然后将5′NCR和NS5B区序列与24个HCV全基因参考序列(均来自GenBank)比对并构建遗传进化树。结果:对3例分型结果为6 a型的样品进行5′NCR序列分析发现,这3例样品都具有6 a型特征性的第-145位的CA碱基插入,且与6 a型参考序列Y12083的同源性最高,分别为0.993,0.987,0.993;进化树分析表明,3例样本都属于6 a型。然而NS5B区的序列分析结果表明,95,126,150在NS5B区与1b型参考序列HC-J4的同源性最高,分别为0.934,0.930,0.926;进化树分析结果也显示它们都属于1b型,两个区的分型结果完全不同。为排除引物扩增效率的问题,使用6 a型特异的引物对3例样品进行NS5B区扩增,3例样本扩增结果均为阴性。结论:我们发现的HCV 6 a型的感染中,存在3例样品5′NCR和NS5B区的分型结果不一致,尚无直接证据证明其是否发生了基因重组。但是,我们的结果提示,在两个或两个以上区域进行HCV分型是非常重要的,且HCV基因型之间的重组必须纳入到HCV分型的考虑中来。
- 张瑞李俊强刘丽君杜绍财魏来
- 关键词：肝炎病毒基因型
