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李占军
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2
被引量:3
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江苏省人民医院
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钱祝银
江苏省人民医院
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江苏省人民医院
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小鼠miR-125b慢病毒过表达载体构建与鉴定
2013年
目的构建小鼠胰腺β细胞NIT-1中miR-125b慢病毒过表达载体。方法从小鼠基因组DNA中用PCR扩增miR-125b的前体序列,经NheⅠ和PstⅠ酶切后连接到Lv-CMV-GFP载体中,并对重组质粒进行双酶切鉴定和测序分析。将miR-125b过表达载体、pVSV-G和delta8.91质粒共转染293T细胞,收获慢病毒感染NIT-1细胞,流式细胞术分选阳性细胞,RT-PCR鉴定稳转细胞株中miR-125b的表达。结果成功构建了miR-125b慢病毒表达载体,感染小鼠胰腺β细胞NIT-1后能够成功过表达miR-125b。结论成功构建miR-125b慢病毒过表达载体,为进一步研究其功能建立了实验基础。
顾玉青
孙杰
李占军
高文涛
钱祝银
关键词:
胰腺Β细胞
MicroRNA-200b在吉西他滨诱导的胰腺癌细胞株MiaPaCa-2上皮间质转化中的作用
被引量:3
2013年
目的探讨MicroRNA-200b(miR-200b)在吉西他滨诱导的胰腺癌MiaPaCa-2细胞上皮间质转化(EMT)过程中的作用。方法应用不同浓度的吉西他滨诱导MiaPaCa-2细胞,选择50%细胞生长抑制时的药物浓度(IC50),获取耐药MiaPaCa-2细胞。采用脂质体法将miR-200b和无意义小分子片段(阴性对照)分别转染MiaPaCa-2细胞,再用IC50的吉西他滨诱导细胞,获取转染miR-200b的耐药MiaPaCa-2细胞及阴性对照的耐药MiaPaCa.2细胞。倒置显微镜下观察细胞形态变化;Transwell小室测定细胞侵袭能力;实时定量PCR检测细胞miR-200b表达;蛋白质印迹法检测细胞E—cadherin、Vimentin、Zebl、Zeb2蛋白表达。结果吉西他滨处理后细胞体积逐渐缩小,呈纺锤样,细胞间连接减少,伪足增多,呈现间质细胞特征。耐药MiaPaCa-2细胞的穿膜数从亲本细胞的(26±3)个上升至(85±6)个,Vimentin、Zebl、Zeb2表达分别上升至亲本细胞的(1.87±0.17)、(2.57±0.21)、(5.24±0.83)倍,miR-200b表达下降至亲本细胞的(0.36±0.01)倍,E-cadherin表达下降至亲本细胞的(0.47±0.05)倍。而转染miR-200b的耐药MiaPaCa-2细胞的穿膜数下降至(42±4)个,Zebl、Zeb2表达下降至阴性对照的耐药MiaPaCa-2细胞的(0.36±0.07)、(0.08±0.01)倍。结论吉西他滨诱导胰腺癌MiaPaCa-2细胞过程中细胞出现EMT,其机制可能与miR-200b表达下调有关。
顾玉青
李占军
张静静
高文涛
钱祝银
关键词:
胰腺肿瘤
微RNAS
吉西他滨
上皮间质转化
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