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重组蛋白PTD-HSP27的制备及其穿细胞膜和角膜组织的功能研究被引量：5: 2015年; 目的:制备PTD-HSP27蛋白并研究其能否穿过人晶状体上皮细胞SRA01/04细胞膜及新西兰大白兔的角膜组织进入眼前房。方法:利用重叠延伸PCR法获得重组目的基因片段PTD-HSPB1-6His,构建重组质粒p KYB-PTD-HSP27-6His,原核诱导PTD-HSP27蛋白表达及纯化重组蛋白后对其进行Western blotting鉴定;用异硫氰酸荧光素(FITC)标记重组蛋白PTD-HSP27并检测其穿透SRA01/04细胞膜的能力及兔眼角膜组织的能力。结果:成功构建并纯化制备目的蛋白PTD-HSP27,在PTD-HSP27孵育后的SRA01/04细胞及结膜囊滴注PTDHSP27兔眼前房内均可检测出重组蛋白PTD-HSP27。结论:通过重叠延伸PCR法及镍柱层析纯化法可以获得较纯的重组蛋白PTD-HSP27;重组蛋白PTD-HSP27能够穿透SRA01/04细胞膜及穿越兔眼角膜进入房水。; 刘莲余榕捷戴云曾智星郭晓令季青山钟敬祥; 关键词：蛋白转导域热休克蛋白27 晶状体上皮细胞

荧光互补与光能量共振转移检测B类G蛋白偶联受体PAC1二聚化被引量：2: 2012年; G蛋白偶联受体(G-protein couple receptors,GPCRs)是最大的超家族膜受体,其中它的B家族成员垂体腺苷酸环化酶激活肽1(PAC1)是垂体腺苷酸环化酶激动多肽(PACAP)的特异受体,介导PACAP神经保护等功能,是神经系统疾病药物开发的重要靶点之一。二聚化或寡聚化是GPCRs普遍存在的现象,但是目前尚没有关于PAC1形成同源二聚体或寡聚体的报道。为了验证PAC1也能进行同源二聚化,该文采用生物发光能量转移(bioluminescence resonance energy transfer,BRET)方法进行检测,结果显示不同浓度梯度共转染中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary,CHO)的PAC1-Rluc与PAC1-EYFP重组载体,在底物腔肠素h(coelenterazine h)作用下呈现明显的BRET信号。双分子荧光互补(BiFC)检测显示,带有EYFP N端基因标记的PAC1与带有EYFP C端基因标记的PAC1共转染CHO细胞,能呈现完整的EYFP荧光信号。同时,Western blot检测也显示,高表达PAC1的细胞中可检测到PAC1二聚体的大分子。因此,PAC1是能够进行正常同源二聚化的,这个发现将为后续神经损伤药物的开发奠定全新的理论基础,同时也为其他GPCRs同源二聚化的研究起到启发和借鉴作用。; 郭晓令余榕捷钟佳萍李梅曾智星刘晓飞; 关键词：GPCRS

中西医结合治疗慢性葡萄膜炎疗效的Meta分析被引量：1: 2014年; 目的:评价慢性葡萄膜炎患者行中西医结合疗法的疗效和复发情况。方法:以"中西医结合"、"慢性葡萄膜炎"、"integration of traditional and western medicine"、"chronic uveitis"为主题词使用计算机检索中国知网(CNKI)、万方数据库、维普数据库、Medline(1966年1月至2013年7月)、EMbase(1966至2013年)、Cochrane图书馆(2013年)等中、英文数据库,并用Google等搜索引擎在互联网上查找中西医结合治疗慢性葡萄膜炎相关文献。提取文献的相关原始数据,采用Meta分析方法,对国内已公开发表的7篇文献作分析,按中西医结合组与西医组进行统计。结果:中西医结合组对慢性葡萄膜炎有确切的疗效,同西医组比较,治疗有效率差异有统计学意义(P<0.05),治疗复发率差异有统计学意义(P<0.05)。结论:慢性葡萄膜炎患者运用中西医结合疗法能达到较好效果,在减少复发方面优于单纯西医疗法。; 刘庆郭晓令丁勇陈建苏; 关键词：慢性葡萄膜炎中西医结合 META分析

B族G蛋白偶联受体PAC1二聚化及其N端HSDCIF基序对其二聚化的影响: 目的：G蛋白偶联受体（G-proteincouplereceptors,GPCRs）是最大的超家族膜受体，其中它的B家族成员PAC1是垂体腺苷酸环化酶激动多肽（pituitaryadenosine acid cycliz...; 郭晓令; 关键词：G蛋白偶联受体二聚化; 文献传递

Transwell 接触共培养促进单散iPSCs 生长及分化被引量：2: 2014年; 目的：观察Transwell接触共培养促进单散人诱导多能干细胞（inducedpluripotentstemcells， iPSCs）生长及分化的作用。方法：将1～2代牛角膜内皮细胞（corneal endothelial cells， CECs）接种在Transwell 小室底面培养8 h后，应用Accutase消化及40μm过滤处理获得单散iPSCs，将其接种到已有CECs的Transwell小室内共培养14 d，前3 d使用mTeSR1培养基，第4天开始用含10％胎牛血清的低糖DMEM培养基。分别进行实时荧光定量聚合酶链式反应（ real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction ， qPCR ）、免疫荧光、死活细胞染色及碱性磷酸酶（ alkaline phosphatase ， ALP）染色，对iPSCs多能特性表达及分化进行鉴定。设定单散iPSCs共培养组为实验组，常规培养iPSCs组为对照组（一），非共培养单散iPSCs组为对照组（二）。结果：培养牛CECs形态呈典型的六边形铺路石样外观。人iPSCs呈克隆样生长，共培养3 d后iPSCs贴壁呈单散细胞生长，免疫荧光检测未分化标志Nanog和Oct4呈阳性。 qPCR检测Nanog、Oct4和Sox2 mRNA表达，实验组与对照组（一）比较差异无统计学意义（P＞0.05）。死活细胞染色显示，实验组死细胞明显减少，与对照组（二）比较差异有统计学意义（P＜0.01）。共培养14 d后，人iPSCs形态比较均一，呈多边形，体积增大，无明显克隆团块；ALP染色阴性；免疫荧光染色ZO-1、AQP1和CD31表达阳性，CD34和CD133表达阴性。 qPCR检测Oct4、Nanog和Sox2 mRNA表达明显下调，与对照组（一）比较差异有统计学意义（P＜0．01）。结论：与牛CECs共培养可增强人单散iPSCs活性，使iPSCs形态上向内皮样细胞转化，表达部分CECs的标志。 Transwell接触共培养模型可以促进单散iPSCs生长及分化。; 刘庆郭永龙郭晓令连瑞玲陈建苏; 关键词：诱导多能干细胞角膜内皮细胞

重编程诱导多功能干细胞的研究进展被引量：4: 2014年; 诱导多功能干细胞（ induced pluripotent stem cells，iPSCs），即通过不同的转导方法，将影响重编程的关键转录因子、RNA、蛋白或小分子化合物导入到成体细胞，使其＂返老还童＂回到胚胎干细胞状态，并能够被诱导分化产生不同的细胞类型。 iPSCs 的问世，对干细胞的发展具有划时代的意义，使得患者来源的体细胞可以被诱导成iPSCs，用于相关疾病的检测分析与干细胞治疗，规避了免疫排斥和道德论理等问题。但是由于iPSCs诱导的低效性和致瘤性，使得这个＂新星＂在临床中的应用被质疑，目前科学家一直围绕这2个核心问题展开研究，通过改进转导途径，改变重编程方法来提高它的安全性和效率，并取得了一系列喜人的结果，从而使iPSCs未来用于临床的前景变得越来越光明。; 郭晓令刘庆王婵郭永龙余榕捷陈建苏; 关键词：安全性有效性

Maxadilan对人脂肪干细胞的影响被引量：2: 2015年; 目的:探讨垂体腺苷酸环化酶激活肽Ⅰ型受体(PAC1受体)特异激动剂maxadilan对人脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ASCs)的增殖、凋亡和分化潜能的作用。方法:取人脂肪组织通过酶消化法分离培养ASCs。流式细胞术鉴定ASCs表面标志物,并进行ASCs向成骨成脂定向诱导。CCK-8法和流式细胞术检测maxadilan对ASCs活性的影响。采用波长为254 nm的紫外线(ultraviolet C,UVC)照射ASCs,CCK-8法测定不同剂量的UVC诱导ASCs凋亡后的吸光度。选择剂量为702 J/m2的UVC照射ASCs 24 h后,用流式细胞术和caspase 3和caspase 9试剂盒检测maxadilan对ASCs凋亡的影响。结果:流式细胞术检测表明细胞CD29、CD44、CD59和CD105表面抗原阳性,证实所提取的细胞是ASCs。CCK-8法检测发现80 nmol/L浓度的maxadilan对ASCs促增殖作用最强,流式细胞术分析也证实80 nmol/L maxadilan处理显著促进ASCs的增殖,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。与仅被702 J/m2UVC照射的ASCs比较,80 nmol/L maxadilan显著抑制同等剂量UVC照射ASCs所诱导的、与caspase 3和caspase 9活性相关的细胞凋亡,2组比较差异有统计学意义(P<0.05)。同时,2组细胞成骨和成脂的诱导分化均为阳性。结论:Maxadilan促进ASCs增殖,抑制ASCs凋亡,且不改变细胞向成骨和成脂诱导分化的潜能。Maxadilan有利于ASCs的体外生长与扩增。; 连瑞玲郭晓令郭永龙刘庆陈建苏; 关键词：MAXADILAN 短波紫外线脂肪干细胞

B族G蛋白偶联受体PAC1的N端基序HSDCIF对其二聚化和上膜运输的影响: 2013年; B族G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors,GPCRs)PAC1是垂体腺苷酸环化酶激活多肽(pituitary adenylate cyclase activating polypeptide,PACAP)的特异受体,介导PACAP神经保护等功能,是神经系统疾病药物开发的重要靶点之一.HSDCIF(His-Ser-Asp-Cys-Ile-Phe)为位于PAC1的N端胞外1区(extracellar domain 1,EC1)的一段短肽序列,与特定负责激活PAC1受体的激动域PACAP(1-6)具有极高的同源性.利用基因敲除技术构建出缺陷HSDCIF基序的PAC1突变体(简称D-PAC1);利用基因工程原理和技术构建系列真核表达重组载体,包括融合了增强型黄色荧光蛋白(enhanced yellow fluorescent protein,EYFP)的表达载体D-PAC1-EYFP;用于生物发光能量转移(bioluminescence resonance energy transfer,BRET)检测的D-PAC1-Rluc;以及用于双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation,BiFC)实验的D-PAC1-EYFP/N和D-PAC1-EYFP/C.免疫荧光检测(immunofluorescence assay)测定D-PAC1的表达;荧光共聚焦显微观察D-PAC1的细胞运输,然后通过Western印迹、BRET与BiFC方法来检测D-PAC1的二聚化情况,综合评价HSDCIF基序对PAC1二聚化和在细胞中定位的影响.检测结果显示,缺陷HSDCIF基序的突变体D-PAC1不能发生二聚化,也不能正常的进行上膜运输,而是滞留在内质网中,同时外源化学合成的寡肽HSDCIF可以竞争性地抑制正常PAC1的二聚化.; 郭晓令余榕捷曾智星李梅钟佳萍张华华; 关键词：二聚化

非集落样、分散的人诱导多能干细胞可分化为球型可移植的功能性视网膜色素上皮细胞被引量：1: 2021年; 目的:从人诱导多能干细胞(hiPSC)分化而来的视网膜色素上皮(RPE)细胞在治疗视网膜退行性疾病方面有很大的前景。本研究将探讨非集落样、分散的hiPSC分化为功能性RPE细胞(hiPSC-RPE细胞)的可能性,并提供一种基于细胞球的可选移植方法。方法:通过RT-PCR、免疫荧光和流式细胞术分析鉴定hiPSC-RPE。通过荧光素渗漏实验、跨上皮电阻测定、原子力显微镜观察、光感受器外节段吞噬实验、冰冻切片、死/活细胞染色、衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色和免疫组化实验评估hiPSC-RPE的体内和体外功能。结果:hiPSC-RPE细胞阳性表达RPE细胞的生物标志物但不表达iPSC的生物标志物,例如CRALBP(97.4%)、EMMPRIN(93.8%)、Oct4(2.1%)和Sox2(2.0%)。hiPSC-RPE细胞表现出与RPE细胞一样的特性,包括屏障功能、吞噬活性和极性膜。hiPSC-RPE成球处理后细胞阳性表达nestin,并且SA-β-Gal染色减少(P<0.01)。hiPSC-RPE细胞球在脱细胞基质角膜上培养能形成单层。在碘酸钠诱导的RPE退化的青紫蓝兔视网膜下腔移植1个月,hiPSC-RPE细胞球能存活下来,并维持部分片状结构生长。结论:非集落样、分散的hiPSC能有效分化为功能性RPE细胞,而且移植后的hiPSC-RPE细胞球能在RPE退化的青紫蓝兔视网膜下腔维持部分片状结构生长。本研究可能为未来治疗RPE退行性疾病提供一种可选的细胞球移植方法。; 郭晓令朱德良连瑞玲曾巧浪Sanjana MATHEW唐仕波陈建苏; 关键词：视网膜色素上皮细胞细胞分化细胞球

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郭晓令

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