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卵巢癌相关抗原CA125单克隆抗体的制备: 2013年; 目的制备卵巢癌相关抗原CA125R单克隆抗体,并进行鉴定。方法将CA125一段串联重复序列(CA125R)基因克隆至原核表达载体pGEX-6P-1,构建重组表达质粒pGEX-CA125R,转化大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3),IPTG诱导表达GST-CA125R融合蛋白。表达的融合蛋白经GST亲和层析柱纯化后,免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备CA125单克隆抗体,Western blot法鉴定抗体的特异性,单克隆抗体亚类测定试剂盒分析单抗的亚类。腹水诱生法大量制备单抗,SDS-PAGE分析单抗的纯度,间接ELISA法检测单抗的效价。结果重组原核表达质粒pGEX-CA125R经双酶切及测序,证实构建正确;纯化的GST-CA125R融合蛋白相对分子质量约44 000,纯度约为95%,可与小鼠抗GST单克隆抗体发生特异性反应;获得1株可稳定分泌抗CA125单克隆抗体的杂交瘤细胞株3-B2,其分泌的单抗能特异识别GST-CA125R融合蛋白和天然CA125糖蛋白,其抗体亚型为IgG2a型;纯化的腹水单抗纯度约为90%,效价达1×106以上。结论成功获得1株能特异性识别天然CA125糖蛋白的单克隆抗体细胞株,并经腹水诱生法大量制备了抗体,为CA125临床检测试剂盒的研发奠定了基础。; 梁勤东马婷婷董晋豫李武县汪先桃李紫微王秦熊海玉涂植光; 关键词：卵巢癌肿瘤相关抗原 CA125 单克隆抗体

卵巢癌相关抗原CA125串联重复序列的原核表达纯化及抗血清制备被引量：1: 2012年; 目的:建立CA125串联重复序列(CA125R)原核表达系统,表达纯化重组CA125R蛋白并制备其抗血清。方法:全基因合成一段CA125串联重复序列,并将其克隆至pET-32a(+),构建CA125R蛋白原核表达载体pET-CA125R;将构建好的pET-CA125R载体转化至E.coli BL21(DE3),确定最佳可溶性表达条件,通过Ni-NTA亲和层析系统纯化重组CA125R蛋白;纯化重组蛋白经Western blot方法验证后,免疫家兔制备抗血清。结果:成功构建CA125串联重复序列原核表达载体,确定了最佳可溶性诱导表达条件(0.5 mmol/LIPTG,15℃诱导6 h);Western blot结果证实纯化的重组蛋白正确,纯度高;制备的抗血清能特异识别重组CA125R蛋白和天然CA125糖蛋白。结论:成功建立了CA125R高效原核表达系统,并制备了高纯度重组CA125R蛋白及其抗血清。; 梁勤东郭变琴汪仙桃李武县董晋豫王秦涂植光; 关键词：CA125 原核表达抗血清制备

强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞微小RNA的差异表达被引量：6: 2013年; 目的探讨强直性脊柱炎患者和健康对照组外周血单个核细胞已知微小RNA（miRNA）差异表达。方法分别构建10例强直性脊柱炎患者和9例健康对照组外周血单个核细胞小RNA文库，并运用新一代高通量Solexa测序技术，进行外周血单个核细胞已知miRNA的检测；运用实时荧光定量聚合酶链反应（FQ—PCR）进一步验证部分差异miRNA表达。结果在强直性脊柱炎患者与对照组中小RNA文库中，共获得小RNA总量分别是7511859和10178958，比对上基因组部分小RNA分别是6052911（80．58％）和8476243（83．27％）；已知miRNA分别是267和231个，通过miRNA差异性分析，129个上调miRNA和28个下调miRNA，其表达水平差异有统计学意义（P〈0．05）；FQ—PCR进一步验证了let-7b-3p、miR-146a-5p、miR-155—5p、let-7g-5p和miR-323a-5p差异表达水平与Solexa测序结果相似趋势。结论强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞miRNA的差异表达，可能与强直性脊柱炎发病密切相关。; 蔡安季戴勇李武县李紫微涂植光; 关键词：强直性脊柱炎微小RNA 外周血单个核细胞高通量测序

IgA肾病患者肾脏组织中差异表达microRNAs的筛选: 2013年; 目的了解IgA肾病患者肾脏组织全基因组miRNA的表达特征及其作用。方法分别收集6例IgA肾病患者肾穿组织和6例镜下病理检查正常的肾皮质组织,运用Illumina高通量测序技术分别对其miRNA表达水平进行检测,比较分析两组miRNA的表达差异,并运用生物信息学技术对其功能进行初步分析。结果在两组样本中具有显著性差异表达的miRNA有168种,其中在IgA肾病组中表达上调的有33种,表达下调的有135种;另外还有30种miRNA在对照组中特异性表达。结论 IgA肾病患者与对照组样本的组织miRNA表达有显著性差异。miR-148b、miR-152可能与IgA1分子糖基化缺陷有关,而miR-200家族、miR-23b、miR-126和miR-192等可能在肾脏病理改变中起重要作用。; 谭奎璧陈瑜瑜沈雪美李武县罗朝阳戴勇; 关键词：微小RNA IGA肾病

唐氏综合征胎儿脐带血单个核细胞microRNA差异表达研究被引量：2: 2012年; 目的检测唐氏综合征(Down syndrome,DS)胎儿和正常胎儿脐带血单个核细胞全基因组microRNA(miRNA)的差异表达。方法运用Solexa高通量测序技术对6例DS胎儿(DS组)和6例正常胎儿(对照组)脐带血单个核细胞miRNA表达水平进行检测,比较分析2组miRNA表达的差异,并用Stem-loop qRT-PCR对Solexa测序结果进行验证。结果 2组样本显著性差异表达miRNA有167种,8种miRNA在DS组样本中表达上调,159种miRNA表达下调;还有38种和139种miRNA分别特异性表达于DS组和对照组样本中;21号染色体上5个miRNA,除miR-802在DS组中高表达外,miR-99a、let-7c、miR-125b和miR-155均低表达。结论 DS胎儿和健康胎儿脐带血单个核细胞miRNA的表达差异显著,可能与DS胎儿免疫系统的发育缺陷及DS胎儿循环T、B淋巴细胞数目的减少有关;差异显著和特异性表达的miRNA可作为DS胎儿潜在的产前筛查诊断指标。; 李武县徐勇李紫微乔王敏曾君戴勇涂植光; 关键词：微RNAS 唐氏综合征胎血

唐氏综合征胎儿21号染色体上新微小RNA基因的鉴定和功能分析被引量：1: 2012年; 目的:利用Solexa高通量深度测序技术鉴定21号染色体上新的微小RNA(miRNA)基因,为阐明21号染色体功能、探索唐氏综合征(DS)患者新的治疗靶点提供依据。方法:收集5例经染色体核型分析诊断为DS胎儿的脐带血和3例正常胎儿脐带血,分析染色体核型;提取胎儿脐带血单个核细胞总RNA,构建小RNA文库,采用Solexa高通量深度测序、计算机分析、Stem-loop RT-PCR法鉴定miRNA基因并分析其生物学功能。结果:血染色体核型分析,5例DS胎儿脐带血显示DS标准核型,3例正常胎儿脐带血显示正常核型;在DS胎儿脐带血中共发现21个新miRNA,其中仅1个候选miRNA来源于21号染色体,位于21号染色体的"DS关键区域",命名为"miR-nov21",后者在DS胎儿脐带血单个核细胞中表达水平高于正常胎儿。生物学功能分析,miR-nov21可调节211个靶基因共215个位点,与基因的表达、细胞分化的调节、胚胎形态的发生和心脏的发育有关。结论:21号染色体"DS关键区域"存在1个新的miRNA基因———miR-nov21。; 李武县徐勇刘雪燕秦晓林梁勤东戴勇涂植光; 关键词：微小RNA 唐氏综合征脐带血

环氧化酶-2基因shRNA重组腺病毒的构建及鉴定: 2013年; 目的构建携带增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)标签的环氧化酶-2(cyclooxyge-nase-2,COX-2)基因shRNA重组腺病毒,并观察其对肝癌细胞SMMC-7721增殖的影响。方法将前期构建的真核表达质粒pGenesil-1-COX-2-shRNA及阴性对照质粒pGenesil-1-HK的表达启动子U6及shRNA序列亚克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrack中,构建重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-U6-COX-2-shRNA-EGFP和pAdTrack-U6-HK-EGFP,酶切及测序鉴定正确后,经PmeⅠ线性化,转化感受态AdEasier,构建重组腺病毒质粒pAd-U6-COX-2-shRNA-EGFP和pAd-U6-HK-EGFP,经PacⅠ线性化,转染AD293细胞,包装重组腺病毒Ad-U6-COX-2-shRNA-EGFP和Ad-U6-HK-EGFP,经3轮扩增后,测定滴度。RT-PCR和Western blot法检测感染细胞中COX-2基因mRNA的转录及蛋白的表达,MTS法观察重组腺病毒对肝癌细胞SMMC-7721增殖的影响。结果重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-U6-COX-2-shRNA-EGFP和pAdTrack-U6-HK-EGFP及重组腺病毒质粒pAd-U6-COX-2-shRNA-EGFP和pAd-U6-HK-EGFP经酶切和测序鉴定均构建正确,并成功转染AD293细胞,经包装和3轮扩增后,重组腺病毒Ad-U6-COX-2-shRNA-EGFP和Ad-U6-HK-EGFP的滴度分别为1.4×1012和2.0×1012pfu/ml。重组腺病毒感染的SMMC-7721细胞中COX-2基因mRNA、蛋白相对表达量及细胞增殖能力均明显低于空白对照组及阴性对照组(P均<0.05)。结论成功构建了COX-2基因shRNA重组腺病毒Ad-U6-COX-2-shRNA-EGFP,且可显著抑制肝癌细胞SMMC-7721的增殖,为进一步研究COX-2作为肝癌基因治疗靶点及机制奠定了基础。; 董晋豫王秦梁勤东李武县马婷婷熊海玉李紫微涂植光; 关键词：环氧化酶-2基因短发夹RNA 腺病毒基因治疗

TFPI-2对人肝癌细胞生长增殖、凋亡及AFP合成的影响被引量：5: 2011年; 目的:探讨TFPI-2基因对人肝癌细胞Hep3B生长增殖、凋亡及甲胎蛋白AFP表达的影响。方法:将重组质粒PCDNA3.1-TFPI-2转染Hep3B细胞并经G418稳定筛选后,RT-PCR和Westernblot检测转染前后TFPI-2 mRNA和蛋白表达水平,采用CCK-8法、生长曲线观察TFPI-2对人肝癌细胞Hep3B生长增殖的影响,通过平板克隆形成实验观察单个细胞的增殖能力,RT-PCR检测AFP mRNA的表达,并用电化学发光法测定培养上清液中甲胎蛋白AFP含量,流式细胞仪检测细胞早晚期凋亡情况。结果:转染成功的Hep3B细胞检测到TFPI-2 mRNA和蛋白的表达;与转染空载体及未转染的细胞相比,转染TFPI-2的细胞生长增殖能力明显减弱;AFP mRNA表达抑制率为16.51%,AFP蛋白分泌明显低于对照组(P<0.01);流式细胞术检测转染TFPI-2的Hep3B细胞早期凋亡率明显增加(24.03%±7.28%vs 8.77%±3.66%)。结论:TFPI-2表达可显著抑制肝癌细胞生长和AFP的表达,同时还能诱导细胞早期凋亡。为进一步探讨靶向TFPI-2的肝癌基因治疗提供了实验依据。; 秦晓林徐勇范晓卿李武县匡文斌成凤涂植光; 关键词：肝癌组织因子途径抑制物-2 甲胎蛋白

强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞中急性时相反应蛋白的差异表达研究被引量：3: 2013年; 目的检测强直性脊柱炎外周血单个核细胞中急性时相反应蛋白表达水平,探讨其与强直性脊柱炎发病的关系。方法收集10例强直性脊柱炎患者和9例健康对照,提取外周血单个核细胞,采用相对和绝对定量的等量异位标签串联质谱技术检测强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞中的急性时相反应蛋白表达水平,并运用Western blot方法进行验证差异表达的触珠蛋白(Hp)和铜蓝蛋白(Cp)。结果基于质谱分析的蛋白组学显示,19种急性时相反应蛋白在强直性脊柱炎外周血单个核细胞中蛋白表达水平明显升高(P<0.05),主要包括补体C3、纤粘蛋白(FN1)、血浆酶原(PLG)、转铁蛋白(TF)、Hp和Cp;Western blot检测Hp和Cp的表达水平与相对和绝对定量的等量异位标签串联质谱技术检测结果具有相同的变化趋势。结论急性时相反应蛋白差异表达可能参与了强直性脊柱炎的发生、发展,有望作为强直性脊柱炎的临床生物标记物。; 蔡安季戴勇李武县李紫微涂植光; 关键词：强直性脊柱炎外周血单个核细胞

应用iTRAQ对唐氏综合征胎儿脐带血的蛋白质组学研究被引量：1: 2015年; 目的筛选并鉴定唐氏综合征胎儿与健康对照者差异性表达蛋白质,以寻找唐氏综合征胎儿的生物标记物。方法应用同位素标记相对和绝对蛋白定量法和功能聚类分析法筛查和分析唐氏综合征胎儿脐带血和正常胎儿脐带血的差异表达蛋白。结果共筛选鉴定到506种差异表达蛋白,其中最显著的3种蛋白分别是基质蛋白-3、胸腺肽β10和骨桥蛋白。结论唐氏综合征胎儿和正常胎儿脐带血血清蛋白存在较多差异表达蛋白,其中基质蛋白-3、胸腺肽β10和骨桥蛋白等显著差异蛋白可能作为潜在的临床筛查生物标志物。; 文锦丽林秀华郭辉李武县林琳华戴勇; 关键词：唐氏综合征蛋白质组学

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李武县

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