张洪涛
- 作品数：65 被引量：105H指数：6
- 供职机构：首都医科大学附属北京胸科医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金北京科技计划项目北京市科技计划项目更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学文化科学农业科学更多>>
- 脑源性神经营养因子(rBDNF)转基因小鼠载体的构建和体外表达
- 2009年
- 目的构建大鼠脑源性神经营养因子(rBDNF)的条件性转基因小鼠载体,鉴定其在体外细胞系中的表达。方法用PCR方法扩增rBDNF片断,插入pNAO载体(lox-Stop-lox-IRES-EGFP),构建成rBDNF条件性基因载体(lox-Stop-lox-rBDNF-IRES-EGFP),使用Fugene 6转染试剂,将其同Cre重组酶表达质粒pGK-Cre共同导入HEK-293细胞系中,通过荧光显微镜观察、PCR及ELISA方法确定Cre-lox同源重组。结果经酶切和测序鉴定,rBDNF条件性基因载体构建成功。共转染后的HEK-293细胞中,观察到绿色荧光蛋白(EGFP)的强荧光表达;细胞基因组DNA中检测到Cre-lox基因重组;对rBDNF定量检测的ELISA结果显示,细胞内有大量的rBDNF释放到细胞外。结论rBDNF条件性基因载体构建成功,在体外细胞系中,检测到rBDNF及EGFP强表达,为转基因显微注射打下基础。
- 郑小芳那波宏之张洪涛
- 关键词：大鼠脑源性神经营养因子
- 自身免疫性疾病患者PD-L1自身抗体的筛查
- 2016年
- 免疫检查点主要指免疫系统中存在的抑制性免疫调节信号,生理情况下一方面参与维持对自身抗原的免疫耐受,避免自身免疫性疾病,另一方面通过调节外周组织中免疫应答的持续性和强度避免组织损伤。细胞毒性T淋巴细胞抗原-4（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4, CTLA-4）、程序性死亡受体-1（programmed death-1,PD1）及其配体 PD-L1（programmed cell death-ligand 1）是目前免疫检查点研究的热点分子,被认为是免疫调节的主要信号通路。自身抗体是免疫病理调节潜在的调控方式,国外研究主要聚焦于类风湿关节炎（rheumatoid arthritis,RA）,早期文献报道可以检测到CTLA-4自身抗体,近期报道了 RA患者中检出 PD-L1自身抗体。目前国内尚未见相关研究,在其他免疫关联性自身免疫疾病国内外均少有涉及,本研究筛查了多种自身免疫关联性疾病,以及免疫病理为基础的结核病患者PD-L1自身抗体存在状况,明确免疫检查点分子自身抗体调控方式的存在,为研究自身免疫病及免疫关联疾病发病机理、寻求新的治疗策略提供基础研究依据。
- 闫卓红王小珏郑小芳易玲韦攀健贾红艳杨斌张洪涛
- 关键词：自身免疫性疾病PD-L1自身抗体淋巴细胞抗原
- 银染mRNA差异显示方法的建立和二次扩增参数优化
- 2000年
- 目的 优化银染差异显示（ＤＤ－ＰＣＲ）条件和二次ＰＣＲ扩增参数，建立非放射性ＤＤ－ＰＣＲ方法。方法 采用单碱基锚定引物与１０碱基随机引物组合，对大细胞肺癌细胞系８０１－Ｄ总ＲＮＡ模板进行ＤＤＲＴ－ＰＣＲ，行小体积测序胶电泳，银染呈现扩增产物，在胶上直接切取差异条带后，进行再扩增。结果 银染ＤＤ－ＰＣＲ条件经最适化后，可显著足够数量的条带。随机引物５’末端出现ＧＣ扩增效果明显优于３’末端ＧＣ的出现，银染ＤＤ－ＰＣＲ中ｄＮＴＰｓ需要高浓度。差异条带再扩增时，低浓度上下游引物可防止非特异性扩增。结论 银染差异显示方法简便有效，完全适用于一般的科研应用。
- 张洪涛张春燕
- 关键词：MRNA差异显示银染色法基因扩增大细胞肺癌
- 肺癌P53基因治疗的实验研究和预后判断基因标记
- 2003年
- 肺癌死亡率在发达国家居癌死亡的首位.我国1992年流行病学调查资料显示肺癌死亡呈上升趋势,死亡率在大城市占癌死亡第一位.流行病学预测表明,今后30年肺癌死亡将继续增长,成为中国居民的主要死因.
- 汪惠赖百塘李金照岳文涛张洪涛杨学惠张春艳湛秀萍王月刘桂芝
- 关键词：肺癌P53基因基因治疗预后判断基因标记
- 浅谈医学免疫学教学中的实践性被引量：2
- 2015年
- 免疫学是一门介于基础与临床的桥梁学科,内容抽象、系统复杂,知识更新速度快,理论性强,被认为是"天书"课程之一,然而在医学实际中,免疫学又无不渗透影响着医学各个学科,扎实免疫学基础对医学生日后解决临床疑难问题,促进医学的发展,具有极强的指导性。注重"实践"的教学模式,可以使空泛的知识和理论看得见摸得着,进而促进学习的目的性,激发主动性,使理论得到深究,透彻领悟。理论与实践相结合在免疫学教研具有特殊地位,与本学科蓬勃发展有密切关联,注重免疫学科的实践性发展规律,运用于教学,对免疫教学理论学习,培养发现性人才,及对其他自然学科研究有参考价值。
- 张洪涛闫卓红
- 关键词：医学免疫学教学模式
- 结核分枝杆菌可视化抗体检测蛋白芯片的制备被引量：6
- 2009年
- 目的:利用克隆表达的7种结核分枝杆菌优势表位抗原,建立可视化抗体检测蛋白芯片,用于结核病辅助诊断。方法:将7种结核分枝杆菌优势表位抗原,即38kD、ESAT-6、CFP10、MPT64、Mtb8、Mtb8.4和Mtb16.3点于修饰的基片上,制备可检测7种结核抗体的多靶点蛋白微阵列,建立免疫金银染色检测系统;使用该芯片对48例临床结核病患者血液样品进行检测,并与"金标准"痰涂片(48例)和痰培养(其中的29例)检测结果进行比较,分析其敏感性;对30名献血员血液样品进行检测,分析其特异性。结果:可视化抗体检测蛋白芯片的敏感性分别为98.5%和96.6%,而痰涂片和痰培养检测方法的敏感性分别为35.4%和48.3%;可视化抗体检测蛋白芯片的特异性为93.3%。结论:建立的结核分枝杆菌可视化抗体检测蛋白芯片检测敏感性显著高于痰涂片和痰培养方法,可用于结核病的临床辅助诊断,提高痰涂片和痰培养假阴性的检出率。
- 冯晓燕陈坤李惠文宋晓国王国华韦攀健朱翠侠张洪涛张贺秋
- 关键词：结核分枝杆菌
- SPLUNC1-Ig融合蛋白在CHO细胞中的稳定表达及活性初步分析
- 2010年
- 目的 构建短的上腭、肺及鼻咽上皮克隆1（SPLUNC1）-Ig融合蛋白表达体系并初步分析其活性.方法 在质粒PGEM-T easy-SPLUNC1基础上联合应用大引物法和巢式PCR实现目的序列147位碱基的定点突变,亚克隆于表达载体PDH3,构建PDH3-SPLUNC1的表达质粒.稳定转染CHO/dhfr-细胞完成SPLUNC1-Ig融合蛋白的表达,并在氨甲喋呤（MTX）加压下筛选出稳定表达的细胞株,应用ELISA检测蛋白表达的水平.利用蛋白A亲和层析系统纯化获得的SPLUNC1-Ig融合蛋白,并用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和Western免疫印迹进行鉴定,经ELISA、Western免疫印迹分析SPLUNC1-Ig融合蛋白的特异性和活性.结果 经酶切及测序结果证实预定位点已突变,琼脂糖凝胶电泳出现大小为768 bp的目的条带;测序发现SPLUNC1基因的147位碱基A均已突变成C,证实PDH3-SPLUNC1表达质粒构建成功.RT-PCR扩增出768 bp大小的SPLUNC1基因.ELISA检测CHO/dhfr-细胞上清表明SPLUNC1-Ig融合蛋白在3个月内稳定表达,水平与时间的延长无关.经亲和层析获得SPLUNC1-Ig融合蛋白,SDS-PAGE电泳可见相对分子质量约52 500大小的条带.Western免疫印迹也在45 000与66 200之间出现与预测位置相符的特异目的条带.SPLUNC1-Ig融合蛋白浓度为0.39 mg/L时与脂多糖结合活性明显高于阴性对照,6.25 mg/L时与脂多糖结合的A450值基本达到平台期.Western免疫印迹也显示未变性的脂多糖可与SPLUNC1-Ig融合蛋白结合,而变性后却不能与之结合.结论 建立了非切胶纯化的定点突变方法,顺利实现了表达质粒的构建.成功构建SPLUNC1-Ig融合蛋白表达体系,其分泌的目的蛋白具有蛋白的天然结构和体外活性.
- 薛君力赵雁林易玲王小珏李惠文韦攀健郑小芳张洪涛
- 关键词：CHO细胞脂多糖类免疫活性
- 基因工程CAR-T细胞治疗实体瘤机遇与挑战被引量：2
- 2019年
- 恶性肿瘤严重威胁人类生命和健康,通过基因改造T细胞可以重编抗原特异性和功能。其中基因工程表达嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)T细胞,即CAR-T细胞,是一类基于受体合成的创新T细胞过继疗法,其携带不依赖主要组织相容性复合体( major histocompatibility complex,MHC)的特异性抗原受体及免疫调节共刺激分子,实现对肿瘤靶标高效应答。CAR-T细胞治疗在血液肿瘤,尤其是在CD19阳性白血病中疗效显著。然而,该疗法在实体肿瘤中的应用仍面临着一些阻碍,针对性克服这些问题,发展新型实体瘤的CAR-T细胞治疗策略,备受期待。
- 李姝萍张洪涛
- 关键词：实体瘤
- 自身免疫性疾病患者PD-L1自身抗体的筛查
- 2017年
- 目的调查自身免疫性疾病和结核病患者PD—L1自身抗体产生情况。方法以重组人PD-L1蛋白为抗原，间接ELISA和免疫印迹法对血清样本进行测定，包括63例类风湿性关节炎（RA）、38例系统性红斑狼疮（SLE）、42例强直性脊柱炎（AS）、28例干燥综合征（ss）、50例结核病（TB）和60例健康人对照。结果ELISA结果显示，与健康人对照组（0．1317±0．0284，N=20）相比，RA（0．1996±0．0579，P〈0．0001）、SLE（0．1689±0．0338，P=0．0005）和AS组（0．1729±0．0619，P=0．0107）PD-LI自身抗体水平显著增高，而SS组（0．1341±0．0397，P=0．6834）无显著性差异。与健康人对照组（0．1541±0．0139，N=40）相比，结核病组（0．1709±0．1069，P=0．4215）PD—L1自身抗体水平无显著差异，但存在ELISA检测阳性个体，经免疫印迹证实存在PD—L1自身抗体。在46％RA、26％SLE、29％AS、1l％SS和12％TB中可检出PD-L1自身抗体，而健康人对照组未检出。结论自身免疫性疾病可检测到PD-L1自身抗体，此为进一步研究PD-L1与免疫相关疾病和免疫检查点调控机理奠定了基础。
- 闫卓红王小珏郑小芳易玲韦攀健贾红艳杨斌张洪涛
- 关键词：PD-L1自身抗体自身免疫性疾病免疫印迹
- 卡介苗缺失免疫显性抗原在结核病血清学检测中的作用被引量：2
- 2011年
- 目的探讨卡介苗（BCG）缺失免疫显性抗原在结核病血清学检测中的作用。方法选取主流结核病血清学检测抗原的4种不同组合试剂A（结核分枝杆菌抗体IgG检测试剂）、B（结核分枝杆菌抗体检测试剂）、C（结核杆菌特异性抗体检测试剂）、D（活动性结核抗体检测ELISA系统），通过免疫印迹、胶体金和酶联免疫吸附等免疫学方法检测109例活动性结核患者和97名健康人群[分为结核菌素纯蛋白衍生物试验（PPD）阳性和阴性组]的结核抗体，应用贝叶斯概率统计学方法，综合分析不同抗原组合对结核病检测准确率的影响。结果试剂A、B、C、D对活动性结核病IgG检出率分别是80．0％、66．7％、80．7％、56．0％，明显高于健康人群的23．9％、8．9％、6．6％、1．0％，差异均有统计学意义（X2值分别为47．53，51．59，90．48，69．68，均P〈0．01）。其中试剂A、B对健康人群结核抗体检出率随PPD阳性反应强度而增高（X2值分别为2．124，2．220，均P〈0．05），试剂C、D对健康人群结核抗体检出率与PPD反应强度无相关性（X2值分别为0．122，0．479，均P〉0．05），试剂D的准确率最高，其对活动性肺结核患者IgM检出率为2．1％。结论IgG检出的敏感性与抗原的选择及组合数量呈正相关，高的检测敏感性常伴随特异性的损失，选择BCG缺失抗原可显著提高检测特异性。
- 郑小芳易玲韦攀健贾红彦李惠文赵雁林张洪涛
- 关键词：结核抗原卡介苗血清学诊断
