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人心肌肌钙蛋白I基因的人工合成及高效表达被引量：1: 2005年; 目的人工设计合成完整的人心肌肌钙蛋白I(hcTnI)基因,克隆并在大肠杆菌中获得高效表达。方法根据大肠杆菌遗传密码的偏爱性,人工设计合成hcTnI基因,测序正确后通过DNA重组技术将其插入温控型表达载体pBV220,转化大肠杆菌(E.coli)DH5α,构建cTnI基因的非融合表达菌hcTnI-pBV220/DH5α,热激后诱导非融合蛋白的表达,用单克隆抗体检测特异性hcTnI蛋白表达。结果序列分析表明克隆载体中的cTnI人工基因与设计相符,双酶切电泳结果证明表达载体构建成功,经SDS-PAGE证实重组蛋白的相对分子质量(Mr)约24000,凝胶密度扫描约占菌体总蛋白的25%,能与cTnI单克隆抗体特异性结合。结论成功获得cTnI人工基因,构建了cTnI基因原核表达载体并获得了高效表达,为制备高特异性的抗体及临床检测应用奠定了基础。; 徐霞杨能涂洪斌; 关键词：密码子偏爱性克隆

兔抗人心肌肌钙蛋白Ⅰ抗体的制备与鉴定被引量：1: 2006年; 目的制备兔抗人心肌肌钙蛋白I抗体并进行鉴定。方法用人工合成的cTnI蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体,ELISA及Western blot方法检测制备的抗血清效价和特异性。结果此次获得的抗血清 ELISA方法检测抗体滴度达到了1:16 000,检测cTnI的灵敏度最低为10μg/L。Western blot检测表明该抗体可有效识别原核细胞表达及大鼠心脏组织提取物中存在的cTnI蛋白。结论应用该方法成功制备了人cTnI的多克隆抗体,为进一步研究cTnI的结构与功能打下基础,并为有效制备高特异性的单克隆抗体提供借鉴。; 杨能徐霞谢闺娥; 关键词：CTNI 多克隆抗体

人心肌肌钙蛋白Ⅰ的重组表达及其单克隆抗体的制备: 人心肌肌钙蛋白Ⅰ(cTnI)是一个具有209个氨基酸的多肽,研究表明,cTnI仅存在于心肌,是心肌细胞的独特标志,因其在心肌损伤时出现早,持续时间长,目前已被公认为是诊断心肌缺血坏死的'金标准',但因各厂家的cTnI检测...; 杨能徐霞; 关键词：单克隆抗体基因重组基因表达; 文献传递

人心肌肌钙蛋白I的重组表达及其单克隆抗体的制备被引量：4: 2005年; 目的构建人心肌肌钙蛋白I(cTnI)的表达载体,表达cTnI重组蛋白,并制备其单克隆抗体(mAb)。方法以化学方法合成cTnI基因并插入融合表达载体pBV220的多克隆位点,构建重组表达质粒pBV220/cTnI。以重组质粒转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性重组子,经热激诱导目的蛋白的表达,表达产物的免疫学活性用Westernblot进行鉴定。以基因重组的cTnI蛋白为抗原,常规方法免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与NS1细胞融合,获得稳定分泌cTnImAb的杂交瘤细胞株,ELISA检测mAb的相对亲和力;Westernblot检测mAb的特异性。结果酶切鉴定和DNA测序显示cTnI重组表达载体中含有人cTnI全长编码序列。将该重组载体转化入大肠杆菌DH5α中表达所得蛋白经WesternBlot验证为目的蛋白。筛选出2株能稳定分泌特异性抗cTnI的mAb杂交瘤细胞株,免疫球蛋白亚类均为IgG类;Westernblot结果显示,两株单抗识别相对分子量为24000的cTnI单一条带;中和抑制试验表明培养上清中的抗体能明显被cTnI中和;cTnI单克隆抗体的亲和常数为Kaff=1.62×109(mol/L)-1。结论成功地构建了cTnI表达载体、表达出cTnI重组蛋白,制备出抗cTnImAb,为进一步用于cTnI的体外免疫学检测奠定了基础。; 杨能徐霞; 关键词：肌钙蛋白I 抗体单克隆

人心肌肌钙蛋白I的原核表达及其兔抗体的制备被引量：2: 2005年; 目的:构建人心肌肌钙蛋白I(hcTnI)基因的原核表达质粒,在大肠杆菌中表达后,并制备兔抗hcTnI抗体。方法:以化学方法合成hcTnI基因并插入融合表达载体pET21a(+)的多克隆位点,构建重组表达质粒pET21a(+)hcTnI。以重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS,筛选阳性重组子,经IPTG诱导目的蛋白的表达,表达产物的免疫学活性用Westernblot进行鉴定。以表达的hcTnI蛋白免疫家兔,制备抗hcTnI的抗体并进行纯化及特性鉴定。结果:成功地合成hcTnI基因,测序证实序列正确后亚克隆于表达载体pET21a(+)中,经PCR筛选和酶切鉴定获得阳性克隆,序列分析表明其中的插入序列与cTnI基因完全一致。在大肠杆菌中表达出相对分子质量(Mr)为24000的目的蛋白,约占菌体总蛋白的28%,Westernblot分析显示,表达的hcTnI蛋白具有良好的免疫反应性。以纯化的hcTnI免疫家兔后,能有效地刺激特异性抗体的产生,抗血清的效价为3×10-4,且具有良好的特异性。结论:成功地构建hcTnI基因的原核表达载体pET21a(+)hcTnI,并在大肠杆菌中获得高效表达。制备出兔抗hcTnI的抗体,且效价及特异性均较良好,为进一步建立酶联免疫吸附法检测hcTnI奠定了基础。; 徐霞杨能涂洪斌; 关键词：肌钙蛋白I 原核表达抗体

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌PBP2a 382～443片段的原核表达及鉴定被引量：1: 2006年; 目的对编码耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）及青霉素结合蛋白2a（PBP2a）382～443位氨基酸的mecA基因片段进行克隆、表达及鉴定。方法根据基因文库登录的mecA基因的编码序列，针对编码PBP2a382～443位氨基酸的mecA基因片段，设计合成4条寡核苷酸片段，再将4条片段人工拼接成目的基因片段，然后克隆至PET-His载体，经酶切鉴定、测序正确后，转化E.coli BL21（DE3）plysS，用IPTG进行诱导表达，并对表达的蛋白以MRSA胶乳凝集试剂盒进行鉴定。结果构建了相应的PET-His克隆，经诱导表达和鉴定，证实成功表达出目的蛋白。结论成功表达出PBP2a382～443片段，为其进一步的纯化和应用奠定了基础。; 徐霞谢闺娥杨能; 关键词：甲氧西林抗药性载体蛋白质类

mecA基因PCR扩增法检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌被引量：17: 2005年; 目的应用m ecA基因PCR扩增法检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(m eth ic illin res istan tstaphy lococcus aureus,M RSA)。方法临床分离的70株金黄色葡萄球菌,应用m ecA基因PCR扩增法鉴定M RSA,并与苯唑西林纸片扩散法进行比较。结果70株金黄色葡萄球菌用PCR扩增法和纸片扩散法有6株鉴定有差异,4株m ecA基因阳性而纸片扩散法鉴定为敏感,1株m ecA基因阳性纸片扩散法鉴定为临界耐药,1株m ecA基因阴性却表现为苯唑西林耐药,2种方法符合率为91.43%。结论m ecA基因PCR扩增法可以准确、快速判定M RSA,特别是对隐匿型或低水平耐药菌株的检出有重要的价值。; 谢闺娥徐霞杨能; 关键词：MECA基因耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 PCR

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杨能