吴金花
- 作品数：98 被引量：254H指数：10
- 供职机构：内蒙古民族大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金内蒙古自治区自然科学基金黑龙江省“十五”科技攻关项目更多>>
- 相关领域：农业科学医药卫生生物学轻工技术与工程更多>>
- 科尔沁牛中性粒细胞防御素5的原核表达及纯化被引量：1
- 2014年
- 目的原核表达科尔沁牛中性粒细胞防御素5(bovine neutrophilβ-defensin 5,BNBD5),并进行纯化。方法用Trizol试剂提取牛外周血中性粒细胞总RNA,RT-PCR法扩增BNBD5的cDNA序列,与pMD18-T载体连接,构建重组克隆质粒pMD18-T-BNBD5,并进行测序,应用DNA Star生物分析软件对科尔沁牛BNBD5与其他物种(绵羊、山羊、驯鹿、家鼠、人类、鳜鱼、中华蜜蜂)β防御素的核苷酸序列进行同源性比较及进化树分析;对科尔沁牛与其他品种牛(新疆荷斯坦牛、印度水牛、荷兰弗里斯兰牛)β防御素的BNBD5核苷酸序列进行进行同源性比较及进化树分析;将构建正确的重组克隆质粒pMD18-T-BNBD5亚克隆至原核表达载体pET-30a(+),构建重组表达质粒pET-30a-BNBD5,转化大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3),IPTG诱导表达后,利用Ni离子亲和柱纯化,SDS-PAGE鉴定表达产物和纯化产物。结果通过PCR扩增获得了195 bp的BNBD5全长cDNA序列,为一个完整的开放阅读框(ORF),与GenBank中登录的BNBD5编码区序列(AJ278799)相似性达93.4%,推导该序列编码45个氨基酸残基,并含有防御素的特征性分子结构,即在特定位置上有6个保守的半胱氨酸残基;共有13处碱基出现突变,导致其推导的氨基酸序列出现8处变异,但6个保守型半胱氨酸位点均未出现变异。与其他物种的BNBD5核苷酸序列同源性分析表明,科尔沁牛与山羊、绵羊同源性最高,达80%以上;与中华蜜蜂同源性最低,在10%以下。与其他品种牛的BNBD5核苷酸序列同源性分析表明,科尔沁牛与新疆荷斯坦牛同源性最高,达90%以上;与荷兰弗里斯牛的同源性最低,约66%。质粒pET-30a-BNBD5经PCR及单双酶切鉴定证明构建正确,表达及纯化蛋白相对分子质量约10 000,主要以可溶性形式表达,表达量占菌体总蛋白的25.1%,纯化产物含量达2.15 mg/ml。结论成功表达并纯化了科尔沁牛BNBD5。
- 锡林高娃陈鹏乌日汗吴金花布日额
- 关键词：科尔沁牛Β-防御素原核细胞
- 牛乳腺炎无乳链球菌PI-2a菌毛岛屿AP_1-AP_2-BP基因亚单位抗体的制备被引量：2
- 2019年
- 目的构建牛乳腺炎无乳链球菌菌毛岛屿PI-2a亚单位重组抗原AP_1-AP_2-BP,并制备其多亚单位抗体,为后期研制新型免疫疫苗和检测试剂提供实验基础。方法利用延伸PCR技术构建了AP_1-AP_2-BP三联基因,并将该串联基因进行转化,诱导,表达,纯化,并将纯化蛋白制作为抗原,对家兔免疫,制备多亚单位抗体,并通过亲和层析的方式从免疫后的血清中获得纯化的IgG,完成多亚单位抗体的制备。结果 AP_1-AP_2-BP三基因串联重组工程菌株通过诱导、表达,对产物亲和层析等方法获得的纯化蛋白,其相对分子质量为65 kDa,其含量达到3.3 mg/mL,并具有较好的免疫原性。经间接ELISA可知,经过4周的免疫抗体的滴度已达到1∶5 600的水平。通过Protein A280测量数据表明,纯化后的IgG的含量高达9.1 mg/mL。结论牛乳腺炎无乳链球菌的菌毛岛屿AP_1-AP_2-BP三基因串联重组工程菌经诱导、表达后获得的纯化蛋白AP_1-AP_2-BP多亚单位抗原有较好的免疫原性,为制备相应多亚单位抗体的制备提供了良好的多价抗原,同时为将研制新型工程疫苗及检测试剂提供了科学研究基础。
- 王雪吟布日额布日额王金良王金良锡林高娃
- 关键词：无乳链球菌
- 牛乳腺炎无乳链球菌β溶血素对奶牛外周血液单核巨噬细胞吞噬功能的影响被引量：2
- 2020年
- 目的探索奶牛乳腺炎无乳链球菌β溶血素对奶牛单核巨噬细胞吞噬功能的影响。方法利用牛淋巴细胞分离液从奶牛外周血分离获得单核细胞,经培养使其分化成巨噬细胞,利用牛乳腺炎无乳链球菌野生型菌株(BMSA1886βh)及牛乳腺炎无乳链球菌β溶血素基因敲除突变株(BMSA1886△βh)侵染巨噬细胞,通过吖啶橙染色法对其进行染色荧光显微观察,统计巨噬细胞对BMSA1886βh及BMSA1886△βh吞噬率差异。结果巨噬细胞对奶牛乳腺炎无乳链球菌野生型株的吞噬指数(1.16)和吞噬率(58%)显著低于其对与β溶血素突变株的吞噬指数(2.06)和吞噬率(80%),表明β溶血素可抑制巨噬细胞的吞噬作用。结论牛乳腺炎无乳链球菌β溶血素对奶牛外周血液巨噬细胞有一定的抑制作用,被吞噬的野生型无乳链球菌在巨噬细胞内的存活率较突变株相对较高。
- 锡林高娃吴金花吴金花布日额
- 关键词：无乳链球菌巨噬细胞
- 用地高辛标记核酸探针检测鹅细小病毒的研究被引量：26
- 2004年
- 从带有鹅细小病毒(GPV)NS1基因的重组质粒pMD18T NS1用限制性内切酶EcoRI和BamHI双酶切回收1880bp大小片段,并制备出地高辛标记的GPV核酸探针。其标记效率达到0 01pg/μl。特异性检测结果表明,该探针能与GPV不同毒株核酸发生特异性杂交,而与对照的DPV、GPPV等病毒的核酸杂交反应均为阴性;敏感性检测结果表明,该探针对GPV的最低检出量为0 0224pg。该探针对不同方法处理的GPV感染病料进行检测,均出现杂交阳性。表明所研制的标记探针用于GPV的检测是可行的。
- 布日额王君伟吴金花孙红梅Ulrich Neumann
- 关键词：地高辛标记核酸探针鹅细小病毒
- 禽流感病毒株A/duck/Fujian/31/2007(H5N1)株M1基因的克隆及序列分析被引量：1
- 2012年
- 参照GenBank公布的禽流感病毒基质蛋白M1基因序列,设计合成了1对特异性引物,采用RT-PCR法成功扩增并克隆了禽流感病毒M1基因。序列测定结果为M1基因cDNA全长759bp,编码252个氨基酸。将其序列与数株甲型流感病毒M1基因序列进行比较,M1基因核苷酸同源性为99.1%～99.6%,推导氨基酸同源性为98.8%～99.6%,生物信息学分析表明,M1基因编码的蛋白质具有亲水性,有很强的抗原性,M1蛋白共有6个潜在的N-糖基化位点,可能存在3个蛋白激酶C磷酸化位点,存在2个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点。
- 布日额任晓峰李明刚吴金花孙立杰
- 关键词：禽流感病毒克隆
- 内蒙古地区牛乳腺炎粪肠球菌临床分离株全基因组测序与生物信息学分析被引量：1
- 2021年
- 目的对内蒙古地区奶牛乳腺炎临床分离粪肠球菌(Enterococcus faecalis)的基因组进行测序,并预测和分析其生物信息学特征。方法本实验以“内蒙古自治区乳源性致病菌防控工程技术研究中心”分离的粪肠球菌临床分离菌株FC(BME1708)为对象,利用PacBio RS II平台进行全基因组测序,分别使用RNAmmer和tRNAscan-SE软件对菌株基因组中的rRNA和tRNA进行预测,并对测序基因序列进行数据分析、基因注释、耐药性及毒力因子分析。结果测序组装后结果显示,该菌株基因组大小为2934454 bp,其中包含5个双股环状质粒DNA、61个tRNA、12个rRNA,蛋白总数为3151个。耐药性及毒力因子基因预测结果显示,该菌株对庆大霉素、链霉素、β内酰胺、青霉素、四环素、万古霉素等27类抗生素耐药,存在cyl、esp、ace、gel、efaA等82个相关毒力因子。结论已将本次分离的粪肠球菌基因组测序结果登录于GenBank(登录号:CP028835.1),该实验结果将为后续致病及免疫调控机理研究,以及防控策略的制定提供了可靠的生物信息数据。
- 邢家辉锡林高娃吴金花吴金花代牡兰布日额石竞楠
- 关键词：牛乳腺炎粪肠球菌全基因组测序
- GPV VP1-VP3非重叠序列重组原核表达多肽的应用研究被引量：2
- 2007年
- 布日额王君伟吴金花贾伟星马波范铁力李勐Ulrich Neumann李哲迁
- 关键词：GPV原核表达细小病毒感染多肽
- 奶牛乳腺炎无乳链球菌sip、pgk及FbsA基因主要抗原区域的融合表达及抗原性鉴定被引量：9
- 2017年
- 为获得具有无乳链球菌膜表面相关蛋白sip和磷酸甘油激酶pgk及纤连蛋白FbsA三重活性的多亚单位融合蛋白,研究其作为无乳链球菌亚单位疫苗候选抗原的可行性,根据GenBank中已发表的无乳链球菌sip、pgk及FbsA基因的核苷酸序列,利用DNAStar软件对蛋白的抗原表位序列进行分析并设计合成包括重叠PCR引物共4对引物,通过重叠PCR技术将前2个基因主要抗原区域进行拼接后插入pET30a(+)载体,再将第3个基因插入。为减少三重基因串联表达过程中3个蛋白之间空间构象的干扰,在3个基因连接处各引入1段45bp的柔性linker,结果重组基因在BL21感受态中实现了可溶性表达,表达的蛋白约62 000;Western blot试验表明多亚单位融合蛋白可被无乳链球菌多抗识别,且由此融合蛋白制备小鼠多抗能够识别sip、pgk及FbsA等3个蛋白;这表明构建的多亚单位融合蛋白可能具备sip、pgk及FbsA蛋白的三重活性,而且在小鼠的攻毒保护性试验中,重组多亚单位融合抗原对攻毒小鼠的保护优于单个蛋白。本试验为牛无乳链球菌性乳腺炎新型疫苗的研究提供了一定的参考数据。
- 吴金花布日额王金良陈金龙锡林高娃孙立杰王华杜长智白文丽
- 关键词：无乳链球菌
- 牛乳腺炎无乳链球菌PI-2a菌毛岛辅助蛋白AP1、AP2主要抗原域串联表达及其免疫活性鉴定被引量：2
- 2018年
- 利用DNAStar Protean功能筛选AP1和AP2主要抗原结构域,引入15位柔性多肽,通过重叠延伸PCR技术串联融合AP1、AP2主要抗原域基因,PCR扩增串联体基因片段,将其克隆至pET-30a（＋）载体,转化BL21（DM3）细胞,进行高效表达,目的蛋白经亲和层析纯化后进行Western blot鉴定。PCR扩增出320bp的AP1和759bp的AP2主要抗原域,经重叠延伸PCR获得了1 065bp的AP1、AP2串联体基因片段,DNA测序结果表明,无碱基的缺失、突变和移码。构建的重组表达载体经诱导能够可溶性表达,目的蛋白相对分子质量大小约46 000,纯化后重组蛋白的纯度〉96%,Western blot分析重组融合蛋白结果表明,能够被兔源抗无乳链球菌阳性血清所识别。重叠延伸PCR获得了AP1、AP2主要抗原域串联体,构建了pET-30a（＋）/AP1＋AP2重组表达载体,诱导目的蛋白呈可溶性表达,表达产物具有良好的免疫反应原性,为进一步研究基于AP1、AP2蛋白的致病机制,检测制剂及疫苗奠定了试验基础。
- 布日额王金良王金良吴金花锡林高娃孙立杰
- 关键词：无乳链球菌
- 一例猪腰椎骨布氏杆菌病的检疫报告
- 2003年
- 吴金花
- 关键词：检疫症状病理学微生物学检查
