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豌豆乙酰羟酸还原异构酶基因的cDNA克隆及其表达被引量：2: 2001年; 　用ｃＤＮＡ差示分析法从Ｇ２　豌豆总ＲＮＡ中筛选到一个ＧＡ＿３特异诱导表达的基因片段，用该片段作探针进一步筛选Ｇ２豌豆ｃ　ＤＮＡ文库，得到一个全长２０３６　ｂｐ　的ｃ　ＤＮＡ序列．经分析，该ｃ　ＤＮＡ含有一个　１７４６　ｂｐ　的可读框，编码的蛋白质含有　５８１个氨基酸，理论分子量为　６４　ｋｕ，　ｃ　ＤＮＡ及推导的氨基酸序列分别与不同来源的乙酰羟酸还原异构酶相应序列有较高的同源性．将该基因转入表达载体中并在大肠杆菌中表达，获得了具有显著酶活性的外源蛋白．; 徐华松徐云剑顾雪松胡廷章苏彦辉朱玉贤; 关键词：基因克隆原核表达 CDNA文库

PPF1基因C端片段在大肠杆菌中的融合表达和纯化以及抗体制备被引量：7: 2002年; PPF1是与G2豌豆短日不衰老现象紧密相关的基因之一 .以pSK PPF1为模板 ,用PCR方法得到了编码该蛋白C端的基因片段 ,称为PPFC .进一步将该基因片段克隆到中间载体pGEM T easy ,再酶切得到PPFC片段插入到pGEX 4T 1载体中 ,构建成表达质粒pGEX 4T PPFC .在BL2 1细胞中经IPTG诱导表达 ,得到GST PPFC融合蛋白 .用GST亲和柱纯化得到PPFC蛋白 ,将其作为抗原得到兔源的多克隆抗体 .Western杂交分析表明所得到的抗体具有较强的特异性 ,ELISA分析证实其效价为 10 6.该抗体的获得为用免疫沉淀等免疫分析技术研究PPF1与其它蛋白质的相互作用。; 徐云剑苏力坦.阿巴白克力吉栩朱玉贤; 关键词：C端片段大肠杆菌纯化抗体制备多克隆抗体植物细胞

转BmK IT_4基因烟草的抗虫性被引量：20: 2000年; 用酶切方法从pBS_BmKIT4 质粒中获得BmKIT4 基因片段 ,并构建CaMV 35S启动子下的BmKIT4 基因表达质粒pE3_BmKIT4 ,以根癌土壤杆菌 (Agrobacteriumtumefaciens (SmithetTownsend)Conn)介导的叶盘法转化云烟 (Nico tianatabacumL .)K32 6叶片 ,获得 45株抗卡那霉素的再生植株。用这些再生植株进行抗虫试验 ,发现有 2株植株对烟草天蛾 (Manducasexta (Linnaeus) )、棉铃虫 (Heliothisarmigera (H櫣ｂｎｅｒ) )和大豆食心虫 (Leguminivoraglycinivorella(Matsumura) )都有较强的抗性。收获这 2株烟草的自交种子后 ,对T1代幼苗进行Southern杂交分析表明 ,BmKIT4基因已转入这些烟草中 ,用这些子代植株进行抗虫试验 ,与对照株相比 ,这 2株转基因烟草对烟草天蛾的杀虫率达95 %～ 97% ,对棉铃虫的杀虫率达 6 3%～ 70 % ,对大豆食心虫的杀虫率达 6 5 %～ 73% ,并能显著抑制昆虫的蜕皮和生长发育 ,表现出强烈的抗虫作用。; 胡廷章徐云剑江国英朱玉贤; 关键词：烟草抗虫性转基因植物

PPF1与AAIR延缓植物衰老的分子机制研究: G2豌豆(Pisum sativum L.)在短日照条件下能保持旺盛的营养生长而不衰老,在长日照条件下开花后很快即进入衰老期,这一生长特性使G2豌豆成为研究植物衰老调控的重要模式植物.该实验室用cDNA代表群差别分析(R...; 徐云剑; 关键词：植物衰老

用两步PCR法克隆全长cDNA被引量：3: 2000年; 采用两步 PCR法成功地克隆了一个全长的 c DNA.首先 ,用差式分析法克隆得到差别表达的 c DNA片段 ,再分别用这些片段内部的特异序列及 c DNA两端不同接头的序列为引物进行第一步 PCR扩增 ,得到差别 c DNA片段的上游和下游序列 .然后 ,根据第一步 PCR扩增得到的上游和下游序列设计基因特异的引物进行第二步 PCR,从而得到全长的 c DNA.; 苏彦辉徐云剑顾雪松刘天昀朱玉贤; 关键词：全长CDNA 克隆 PCR

PPF1通过延迟胞内钙离子浓度的升高抑制G2豌豆和转基因拟南芥顶端分生组织的细胞程序性死亡: ＜正＞ PPF1基因最初是从短日照下不衰老的G2豌豆中分离得到的, 受到GA的诱导。它定位于叶绿体膜上,编码一个钙离子通道蛋白,可以通过调节植物细胞叶绿体内的钙容量影响转基因拟南芥的开花时间。在转PPF1（+）拟南芥中叶...; 李珺王大勇李晴徐云剑崔克明朱玉贤; 文献传递

定位于类囊体膜的PPF1在转基因拟南芥中的表达影响叶绿体的发育(英文)被引量：3: 2002年; PPF1是一个与植物营养生长相关的基因。它编码的产物可能是一个膜蛋白并与拟南芥叶绿体中的类囊体蛋白ALB3有很高的同源性。免疫电镜分析表明PPF1蛋白同样主要定位于类囊体膜 ,而且在短日照G2豌豆开花两周后仍发育良好的叶绿体中有很高的表达 ,在长日照豌豆同时期非正常叶绿体中丰度非常低。对转基因拟南芥和野生型植株的叶片衰老进程比较发现 ,PPF1在拟南芥中的过量表达可以延缓叶片的衰老 ,而用PPF1反义mRNA抑制拟南芥中的同源基因ALB3则明显加快叶片衰老速度。对转基因拟南芥的超微结构分析显示 ,PPF1在拟南芥中过量表达时 ,转基因植株的叶绿体比野生型植株的叶绿体大并含有更多的基粒和基质类囊体膜 ;相反 ,反义PPF1表达抑制其在拟南芥中的同源物时 ,转基因植株的叶绿体比野生型植株的叶绿体小并含有较少的基粒和发育较差的类囊体膜系统。这些数据表明叶绿体的发育状况与PPF1或拟南芥同源物ALB3的表达水平呈正相关。我们的结果提示PPF1基因可能通过控制叶绿体的发育状况来调节植物的发育。; 徐云剑王大勇朱玉贤; 关键词：类囊体膜转基因拟南芥叶绿体发育免疫定位衰老

G－2豌豆短日不衰老现象的分子细胞学机制初探: G-2豌豆是研究植物个体衰老很有价值的遗传材料,LD(长日照,光照时间每昼夜≥13小时)条件下其顶端分生组织发生花芽分化,从而诱发顶芽及整个个体发生程序性衰老。SD(短日照,光照时间每昼夜<12小时)条件下G-22豌豆个...; 朱玉贤王大勇徐云剑; 关键词：植物发育植物衰老衰老现象

豌豆乙酰羟酸还原异构酶基因结构、蛋白活性分析及其调控机制研究: 2003年; 用PCR方法获得了G2豌豆AAIR基因的核DNA序列,分析表明该基因由8个内含子和9个外显子组成,其中3个内含子带有特征性的富A/T内源启动子区.分子杂交试验表明,短日照条件下G2豌豆中AAIR的表达不受生殖生长的影响,开花前后都维持较高水平的表达.长日照条件下,植株开花后AAIR的表达水平迅速下降.AAIR基因表达强度的变化与豌豆乙酰羟酸还原异构酶的活性变化规律相一致.用乙酰羟酸还原异构酶缺陷型大肠杆菌做功能互补实验发现,带有豌豆AAIR cDNA的细菌能够在缺少分枝氨基酸的M9培养基上生长,表明该基因产物确实具有乙酰羟酸还原异构酶活性.进一步的研究表明,豌豆AAIR基因产物能显著提高野生型大肠杆菌合成分枝氨基酸的能力.凝胶阻滞实验表明,AAIR基因的内含子中的富A/T区能与豌豆核蛋白提取物发生特异性结合.该蛋白在不衰老的短日照G2豌豆顶芽中一直保持稳定表达,但在迅速衰老的长日照豌豆顶芽中,开花后该蛋白就迅速降低直至完全消失.因此,AAIR基因内源启动子区与核蛋白的特异性结合可能是调控该基因表达的重要机制.; 徐云剑顾雪松李珺李晴朱玉贤P.J.Davies; 关键词：豌豆基因结构蛋白活性酶活性

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徐云剑