张珍武
- 作品数：6 被引量：6H指数：2
- 供职机构：华南理工大学生物科学与工程学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家科技基础条件平台建设计划广州市科技攻关项目更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- 结核分枝杆菌融合抗原Ag85B-ESAT6真核表达载体的构建及鉴定被引量：1
- 2006年
- 以结核分枝杆菌H37Rv株的基因组作为模板,将Ag85B和ESAT6编码基因进行PCR扩增,然后采用基因剪接重叠扩增PCR法(gene SOEing)将其通过疏水甘氨酸接头(GGIGIAPG)连接融合,定向克隆至质粒Pvax1中,构建结核分枝杆菌Ag85B-ESAT6融合抗原的真核表达质粒Pvax1/AE.经单双限制性内切酶图谱、PCR产物及DNA测序分析等多种方法鉴定,证实Pvax1/AE真核表达质粒构建成功.为进一步研究其结核核酸疫苗原型的免疫保护效果奠定了基础.
- 程春明曹以诚杜正平杨化强郭旭方翔张珍武
- 关键词：AG85BESAT6融合基因核酸疫苗
- 三重表达肺结核DNA疫苗在细胞水平的检测
- 2008年
- 目的:评估整合siRNA、融合抗原基因、hIL-12的新型肺结核DNA疫苗在人胚肾细胞293中三个表达单元独立互不干扰表达。方法在已构建含有靶向抗调亡基因Mcl-1L的siRNA、结核分枝杆菌抗原基因Ag85B-ESAT6(PVAE)、hIL-12三个独立表达单位的新型肺结核DNA疫苗pVAX-siRNA-PVAE-IL-12基础之上,将抗原基因与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因融合,得到真核表达质粒pVAX1-siRNA-PVAE[EGFP]-hIL12。并将DNA疫苗中的靶向抗凋亡基因Mcl-1L的序列置换为靶向EGFP基因的siRNA序列[siEGFP],得到pVAX1-[siEGFP]-PVAE[EGFP]-hIL12表达质粒。用质粒pVAX1-siRNA-PVAE[EGFP]-hIL12、pVAX1-[siEGFP]-PVAE[EGFP]-hIL12转染人胚肾细胞293,以EGFP为报告基因,分别证实融合抗原基因与siRNA编码序列的表达。以ELISA测定培养细胞上清中hIL-12的表达。结果经酶切鉴定和测序证实肺结核DNA疫苗改造成功。转染细胞中检测到绿色荧光,证实了融合抗原基因的表达。对照组证实了siRNA编码序列表达的抑制效果。转染48h后细胞培养液中hIL-12的检出量为1571.63pg/ml;72h后细胞培养液中hIL-12的检出量为2392.25pg/ml。结论已构建的肺结核DNA疫苗能在真核细胞中有效表达siRNA、抗原基因与hIL-12。为进一步研究该DNA疫苗抗肺结核的免疫保护率和基因治疗效果打下基础。
- 马爱丽曹以诚张珍武
- 关键词：肺结核DNA疫苗SIRNA融合抗原
- 特异性siRNA质粒的构建及其抑制癌细胞中mcl-1表达的研究被引量：2
- 2010年
- 本文构建了靶向mcl-l基因构建的特异性siRNA重组质粒,在细胞水平检测的其抑制效果,并筛选出能高效抑制mcl-l基因表达的siRNA重组质粒,针对mcl-1的特异性siRNA重组质粒,将其转染到人肝癌细胞HepG2,用Rt-PCR(实时荧光定量PCR)方法和WesternBlot方法分别检测转染前后mcl-1mRNA水平和Mcl-1蛋白表达水平,比较对应不同位点的两个siRNA重组质粒对mcl-1的抑制效果。结果表明,Rt-PCR结果显示对应不同位点的两个siRNA重组质粒对mcl-1均可降低mcl-1mRNA水平,最大抑制效率达70.0%,远高于作为对照非相关组;Western-Blot结果显示转染特异性siRNA重组质粒后Mcl-1蛋白表达受到抑制,最大抑制率为44.2%。合理设计的特异性siRNA重组质粒可大幅度下调mcl-1mRNA水平,能有效抑制Mcl-1蛋白表达。
- 徐爱群曹以诚区镜深张珍武
- 关键词：MCL-1基因沉默实时荧光定量PCR
- 结合RNAi技术的三重表达HCV DNA疫苗的构建及其在HepG2细胞中的表达被引量：1
- 2008年
- 目的:构建多表位抗原基因、hIL-12、小分子干扰RNA(siRNA)共质粒表达的新型复合丙型肝炎DNA疫苗并在HepG2细胞中表达。方法:设计并合成复合多表位丙肝抗原基因,将其与加强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因融合克隆进真核表达载体pVAX1的多克隆位点中;利用pVAX1载体上卡那霉素抗性基因与复制起始位点之间的非功能区域,将带CMV启动子的hIL-12表达单元克隆进该区域的BspH I位点中;同时将8组针对丙肝的siRNA表达单元分别克隆进载体复制起始位点下游非功能区域的MluI位点上,构建三重表达的HCV DNA疫苗pVAX1-HC-EGFP-hIL12-siRNA。以该重组质粒转染人肝癌细胞系HepG2,通过EGFP的荧光标记观察多表位抗原的表达;以靶向EGFP的siRNA做为对照验证siRNA的表达及其干扰效果;ELISA测定培养细胞上清中hIL-12的表达。结果:经酶切鉴定和测序证实三重表达的复合HCV DNA疫苗构建成功。在转染细胞中检测到绿色荧光,证实抗原表达;靶向EGFP的siRNA亦能显著抑制EGFP的表达;转染后48 h hIL-12的检出量为1 289 ng/L细胞上清,72 h检出量为1 712 ng/L细胞上清。结论:成功地构建多表位抗原基因、hIL-12和siRNA共质粒表达的丙肝DNA疫苗,并能在真核细胞中有效表达抗原基因、hIL-12并介导RNA干扰效应。为进一步研究该DNA疫苗抗HCV的免疫治疗和基因治疗效果打下基础。
- 杨化强曹以诚杜正平卓敏黄镜贤李新建石川张珍武
- 关键词：DNA疫苗多表位抗原SIRNA
- 新型真核表达质粒pcDNA6/myc-his-EGFP B的构建及其在重组基因表达中的应用(英文)被引量：3
- 2006年
- 增强型绿色荧光蛋白(EGFP, enhanced green fluorescent protein)、myc抗原和6×His已在众多真核表达载体中用作重组蛋白的表达标记,EGFP能发出的绿色荧光,myc抗原能用相应的抗体检测,6×His能被相应的树脂特异吸附。但目前为止,没有一个质粒表达载体能够同时整合三者的功能。本研究构建了一个能够同时整合EGFP、myc抗原和6×His功能的新型真核质粒表达载体,我们将其命名为pcDNA6/myc-his-EGFP B。值得注意的是,为确保目的基因与EGFP基因融合表达后,融合表达产物各组成部分能够保持原有的生物活性,我们运用LINKER程序在EGFP基因的5’端设计了一段编码八肽的连接DNA序列。将一段含有人白细胞介素2(IL-2, humaninterleukin 2)信号肽编码序列的基因亚克隆进pcDNA6/myc-his-EGFP B的多克隆位点中,使之与EGFP、myc抗原和6×His融合表达,构建成质粒pMHES。用pcDNA6/myc-his-EGFP B和pMHES转染2.2.15细胞,48h后成功观察到绿色荧光;用pcDNA6/myc-his-EGFP B尾静脉注射Balb/c小鼠,8h后在小鼠肝脏冰冻切片中同样观察到绿色荧光。用同源建模软件Modeller8V2模拟IL-2与EGFP、myc抗原和6×His融合表达产物的三维结构,结果表明:IL-2、EGFP、myc和6×His各部分互不干扰,连接八肽具有一定的柔性。以上结果表明pcDNA6/myc-his-EGFP B可望作为外源基因在哺乳动物细胞中表达研究和基因治疗的新型载体。
- 李新建曹以诚杜正平杨化强张珍武卓敏
- 关键词：真核表达质粒EGFPMYC
- RNA干扰技术抑制乳腺癌细胞系MDA-MB-231中SATB1的表达
- 2010年
- 构建含有靶向satb1基因的siRNA质粒,体外观察对乳腺癌细胞系MDA-MB-231的SATB1mRNA以及蛋白质表达的影响。设计合成三对靶向人源satb1基因的siRNA,并分别克隆在质粒载体上,在脂质体的介导下转染高表达SATB1的乳腺癌细胞系MDA-MB-231。运用RealTime-PCR方法分析SATB1mRNA的表达情况,Western-Blot方法检测蛋白的表达量。结果表明:经过酶切鉴定和测序证实三个重组质粒psiS823、psiS2567、psiS3373分别构建成功,转染乳腺癌细胞系MDA-MB-231能明显抑制SATB1mRNA及蛋白的表达。说明本试验成功构建的重组质粒psiS823、psiS2567、psiS3373都能有效降低的人乳腺癌细胞MDA-MB-231中SATB1的表达,为SATB1高表达的乳腺癌基因治疗提供了新方法。
- 张瑞曹以诚张珍武杜淑敏徐爱群
- 关键词：乳腺癌SIRNA基因表达
