高飞
- 作品数：9 被引量：22H指数：2
- 供职机构：徐州医学院附属医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金江苏省高校自然科学研究项目江苏省“135”工程重点医学人才基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- HSVI-TK/HSVI-SR39TK-GCV/ACV系统对小鼠T淋巴细胞杀伤作用的研究
- 目的:观察慢病毒载体携带的单纯疱疹病毒1型胸苷激酶(HSVI-TK)和突变型单纯疱疹病毒1型胸苷激酶(HSVl-SR39TK)基因在小鼠T淋巴细胞的表达及前体药物丙氧鸟苷/无环鸟苷(GCV/ACV)对T淋巴细胞的杀伤效应...
- 高飞李振宇鹿群先李德鹏徐开林潘秀英
- 文献传递
- 逆转录病毒与慢病毒介导HSV-TK/GCV防治移植物抗宿主病的比较研究
- 2007年
- 移植物抗宿主病（GVHD）是限制异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）临床应用的最主要并发症，现有的防治方法均不理想，应用自杀基因系统防治GVHD是一个新的尝试。本实验将携带单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）基因的逆转录病毒和慢病毒分别感染供鼠（C57BL／6小鼠）脾细胞，感染后细胞与供鼠骨髓细胞混合移植到经Co^60γ射线照射后的受鼠（BABL/C小鼠），移植后分别给受鼠腹腔注射更昔洛韦（GCV），初步观察HSV-TK／GCV系统控制GVHD的效果，并在体内外实验中对两种载体进行比较研究。
- 杜冰徐开林朱锋高飞陈香梅潘秀英
- 关键词：移植物抗宿主病TK/GCV慢病毒介导逆转录病毒C57BL/6小鼠
- HSV1-TK、HSV1-SR39TK及GCV、ACV对小鼠T淋巴细胞的杀伤作用研究
- 2007年
- 目的观察慢病毒载体携带的单纯疱疹病毒1型胸苷激酶(HSV1-TK)和突变型单纯疱疹病毒1型胸苷激酶(HSV1-SR39TK)基因在小鼠T淋巴细胞的表达及前体药物丙氧鸟苷(GCV)、无环鸟苷(ACV)对小鼠T淋巴细胞的杀伤效应。方法用亚克隆技术将PCR扩增的HSV1-TK、HSV1-SR39TK基因分别连接至慢病毒载体,在TK、SR39TK基因后以内部核糖体进入位点(IRES)连接绿色荧光蛋白(GFP)基因,采用三质粒包装系统包装病毒,将病毒感染刀豆蛋白A激活的小鼠T淋巴细胞,然后通过CCK-8方法观察其对前体药物GCV、ACV的敏感性。结果慢病毒载体携带的HSV1-TK及HSV1-SR39TK基因均可在小鼠T淋巴细胞内高效表达,GCV和ACV对转导TK基因的淋巴细胞均有杀伤作用,含突变型TK基因的淋巴细胞对前体药物敏感性更高,后者对GCV的IC_(50)值比野生型小2.5倍,对ACV的IC_(50)值比野生型小17.4倍。结论表达HSV1-SR39TK基因的T细胞对GCV有更高的敏感性,对ACV也较敏感,应用HSV1-SR39TK基因进行防治GVHD的研究是更好的选择。
- 高飞徐开林潘秀英鹿群先杜冰
- 关键词：移植物抗宿主病HSV1-TKIRES
- 全文增补中
- 不同启动子指导的HSV1-sr39TK/GCV系统对小鼠淋巴细胞的敏感性研究被引量：1
- 2008年
- 目的观察慢病毒载体中不同启动子指导的突变型单纯疱疹病毒1型胸苷激酶(HSV1-sr39TK)基因在小鼠T淋巴细胞内的表达差异,并进一步比较对丙氧鸟苷(ganciclovir,GCV)的敏感性。方法用亚克隆技术将PCR扩增的HSV1-sr39TK基因分别连接至慢病毒载体不同启动子后,然后在HSV1-sr39TK基因后以内部核糖体进入位点(internal ribosome entry sites,IRES)连接绿色荧光蛋白(green fluorescent pro-tein,GFP)报告基因;采用三质粒包装系统包装病毒,将病毒感染刀豆蛋白A(concanavalin,ConA)激活的小鼠淋巴细胞,分别用流式细胞术、RT-PCR法鉴定HSV1-sr39TK和GFP基因在小鼠淋巴细胞的表达,用Cell Counting Kit-8(CCK-8)法观察感染不同病毒的淋巴细胞对前体药物GCV的敏感性。结果不同启动子指导的HSV1-sr39TK及GFP基因均可在小鼠淋巴细胞表达,巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)启动子驱动表达能力最强,磷酸甘油激酶(phosphoglycerokinase,PGK)启动子最弱。感染含CMV启动子病毒的淋巴细胞对GCV的IC50值最小。结论在小鼠淋巴细胞内CMV启动子驱动的慢病毒载体HSV1-sr39TK基因表达最强,对前体药物GCV敏感性最高。
- 高飞徐开林潘秀英鹿群先杜冰
- 关键词：慢病毒载体丙氧鸟苷淋巴细胞
- 内部核糖体进入位点及应用被引量：3
- 2005年
- 真核细胞翻译的起始能在两种不同机制下发生,即帽依赖及内部核糖体进入位点方式。后者需通过形成复杂的RNA结构元件称为内部核糖体进入位点／片段(IRES),位于信使RNA 5′端非翻译区(5′-NTR),在反式作用因子存在的情况下可募集核糖体且不需帽子结构启动翻译。随着研究的深入越来越多的病毒及细胞IRES被发现,并逐渐应用到生命科学的研究中。
- 高飞徐开林潘秀英
- 关键词：内部核糖体进入位点基因治疗
- HSVI-TK/HSVI-SR39TK-GCV/ACV系统对小鼠T淋巴细胞杀伤作用的研究
- 高飞李振宇鹿群先李德鹏徐开林潘秀英
- HSV-TK/HSV-sr39TK基因工程T细胞的研制被引量：2
- 2007年
- 目的:制备慢病毒载体为基础的野生型及突变型单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK/HSV-sr39TK)基因工程T细胞(TK+T及sr39TK+T细胞),观察给予前体药物丙氧鸟苷/无环鸟苷后小鼠T淋巴细胞对其敏感性及存活情况。方法:构建含HSV-TK/HSV-sr39TK及内部核糖体进入位点序列(IRES)和绿色荧光蛋白基因(GFP)的双顺反子慢病毒载体;采用磷酸钙沉淀法将慢病毒载体三质粒转染293T细胞,收集病毒上清感染刀豆蛋白刺激的小鼠T淋巴细胞,给予不同浓度的前体药物GCV/ACV,用Cell Counting Kit(CCK-8)等方法检测T细胞的存活率。结果:转染293T细胞后,病毒滴度达106/U/ml以上;含不同启动子的病毒载体转染效率CMV>PUB>PGK,对小鼠T淋巴细胞的感染效率以CMV启动子最高;IC50值的测定显示sr39TK+T细胞对GCV和ACV的敏感性较TK+T细胞分别提高约2.5和17.4倍;ACV及GCV浓度在1～10μmol/Lsr39TK+T细胞活率下降最为明显,ACV组细胞存活率由(98.4±2.7)%下降为(49.9±5.9)%,GCV组由(97.9%±2.7)%下降为(33.7±5.3)%,P<0.05,随ACV及GCV浓度的增加,细胞活率下降趋势有所减弱;TK+T细胞对GCV敏感,细胞活率由(97.9±2.7)%下降为(38.4±5.5)%,(P<0.05),对ACV不敏感,细胞活率由(98.4±2.7)%下降为(73.8±7.4)%,P>0.05。结论:成功构建了HSV-TK/HSV-sr39TK基因工程T细胞,不同启动子对慢病毒载体在293T细胞的转染效率、转导自杀基因在T淋巴细胞内的表达均有影响;HSV-sr39TK+T细胞对GCV和ACV的敏感性高于TK+T细胞。
- 李振宇徐开林潘秀英高飞何徐彭鹿群先孙海英李德鹏
- 关键词：单纯疱疹病毒胸苷激酶突变型野生型慢病毒载体
- 慢病毒载体介导单纯疱疹病毒胸苷激酶／更昔洛韦系统抑制移植物抗宿主病的实验研究被引量：2
- 2007年
- 目的研究慢病毒载体介导单纯疱疹病毒胸苷激酶／更昔洛韦（HSV-TK／GCV）系统对小鼠异基因骨髓移植（allo—BMT）后移植物抗宿主病（GVHD）的防治作用。方法将转染HSV-TK基因的慢病毒感染供鼠（C57BL／6小鼠）脾脏淋巴细胞，将感染后的淋巴细胞与供鼠骨髓细胞混合，移植给经。Co1射线照射后的受鼠（BALB／c小鼠）。分别于移植后当天、移植后7天（＋7天）和＋12天腹腔注射GCV25mg／kg×7d，观察受鼠生存期、GVHD发生率及严重程度、T细胞亚群（CD3、CD4、CD8）及异基因嵌合等指标。结果HSV-TK／GCV使用0天、＋7天、＋12天组受鼠生存时间分别为（30．10±5．21）d、（36．40±5．28）d、（28．20±4．82）d，三组生存时间均较移植对照组[（15．10±0．43）d]明显延长（P〈0．05）；HSV-TK／GCV＋7天组小鼠50d存活率达60％，高于HSV-TK／GCV0天（40％）和＋12天组（30％）（P〉0．05）。对照组小鼠全部发生Ⅲ～Ⅳ级GVHD，实验组死亡小鼠有Ⅱ～Ⅲ级GVHD病理学改变，而长期生存小鼠仅出现Ⅰ～Ⅱ级GVHD。在＋5，＋10，＋15d，3个时间点实验组小鼠CD4^＋细胞明显高于对照组（P〈0．05），CD8^＋细胞均低于对照组（P〈0．05）。＋30天受鼠异基因嵌合率为100％。结论慢病毒载体介导的HSV-TK／GCV系统能有效控制小鼠allo—BMT后GVHD；＋7天外周血白细胞数开始回升时用GCV控制GVHD效果最佳。
- 徐开林朱锋杜冰高飞程海潘秀英
- 关键词：胸苷激酶慢病毒骨髓移植移植物抗宿主病
- 慢病毒载体介导绿色荧光蛋白基因在小鼠T淋巴细胞中的表达被引量：15
- 2007年
- 本研究构建含绿色荧光蛋白基因的慢病毒载体三质粒系统,并观察其在小鼠T淋巴细胞中的表达情况。应用亚克隆技术将多聚嘌呤通道(PPT)元件、泛醌启动子(PUB)和绿色荧光蛋白基因(GFP)连接至pLO134载体,构建成pTK153载体。之后应用磷酸钙沉淀法将慢病毒载体三质粒系统(包括包装质粒△NRF、转移质粒pTK153和包膜蛋白质粒VSV-G)共转染293T细胞,12小时后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况,72小时收集病毒上清并感染小鼠T淋巴细胞,在荧光显微镜下和应用流式细胞仪(FACS)观察感染情况。结果表明:慢病毒载体的三质粒系统转染293T细胞12小时后在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白表达,FACS分析转染效率为(63.04±7.24)%,病毒滴度测定为(3.09±0.61)×106U/ml。感染小鼠T淋巴细胞后,荧光显微镜下观察到GFP的表达,FACS分析转导效率为(37.98±6.26)%。结论:成功构建了含绿色荧光蛋白基因的慢病毒载体,对小鼠T淋巴细胞有较高的感染效率。
- 李振宇徐开林潘秀英孙海英高飞鹿群先李德鹏何徐彭
- 关键词：慢病毒载体T淋巴细胞绿色荧光蛋白基因
