借助蛋白双向电泳(2-D)技术对感染家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)不同时相的家蚕幼虫马氏管蛋白进行分离,并对其中14个差异蛋白点进行质谱分析.结果表明:10个蛋白点得到成功鉴定,其中的一个可信结果为家蚕一氧化氮合酶(Bombyx mori Nitric oxide synthase,BmNOS).由于诱导型BmNOS是合成巨噬细胞免疫效应因子NO的一种关键特异性蛋白酶,因此通过体内注射BmNPV和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)两种诱导剂,采用半定量和实时荧光定量PCR的方法,对感染组和对照组马氏管中BmNOS不同感染时期的表达进行了定量分析.结果表明:经两种诱导剂处理3 h后,BmNOS表达量均迅速递增,BmNPV侵染组上调约7倍;LPS处理组表达量上调25倍,且该趋势持续至6 h,随后逐渐降低并趋于平稳,这表明BmNOS在家蚕马氏管的免疫中具有重要的功能.
孵化酶是后生动物卵孵化过程中起关键作用的一类蛋白酶。基于生物信息学和RACE方法,从柞蚕胚胎中克隆了一个998 bp的孵化酶样基因全长cDNA,命名为ApHEL(GenBank登录号:JN205047)。ApHEL由15 bp 5'-UTR,98 bp 3'-UTR和885 bp ORF组成。ORF编码294个氨基酸残基,预测蛋白分子质量为33.51 kD,等电点为5.50。在ApHEL N-端存在16个氨基酸的信号肽。ApHEL蛋白酶功能区中含有锌结合序列(HEWMHILGFLHMQSTHNR)和Met-转角基序(YDYVSCLHY)等孵化酶保守功能区域。ApHEL与其他物种孵化酶氨基酸序列的相似度为30.0%～85.0%。基于孵化酶氨基酸序列的进化分析表明,柞蚕、家蚕、库蚊和果蝇聚为一类,亲缘关系较近。ApHEL在早期胚胎中没有转录,至催青第6天开始转录并维持较低水平,在催青第9天剧增至最高值直至孵化,显示ApHEL在柞蚕卵孵化过程中起重要作用。ApHEL在5龄期幼虫的中肠组织中特异性表达,暗示ApHEL可能还有其他生物学功能。
