刘美
- 作品数：2 被引量：2H指数：1
- 供职机构：四川大学华西医院更多>>
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- 异种移植抗原α-gal介导人血清杀伤A549细胞的实验研究
- 2012年
- 背景与目的人体α-1,3半乳糖基转移酶(α-1,3Galactosy ltransferase,α-1,3GT)基因功能失活而不表达α-半乳糖基(α-galactosyl,α-gal)表位,但天然存在着大量抗α-gal抗体,异种器官移植研究结果提示,在人肿瘤细胞上重新表达异种移植抗原α-gal,可能诱发类似于宿主抗移植物超急性排斥反应的抗肿瘤效应。本研究通过基因导入手段,建立稳定表达异种移植抗原α-gal的转基因人肺癌细胞系,探讨α-gal介导的人血清抗肿瘤的可能性及其机制。方法将前期成功构建的α-1,3GT基因真核表达质粒pEGFP-N1-GT瞬时转染人肺腺癌细胞A549,筛选并建立稳定的转基因细胞系A549-GT。MTT增殖实验和显微镜观察转基因细胞生物学特性变化;RT-PCR检测A549-GT中α-1,3GT基因mRNA表达;荧光素标记的凝集素(FITC-BS-IB4lectin)染色检测α-1,3GT在肿瘤细胞表面合成α-gal的能力;A549-GT细胞及其培养基分别与正常人细胞共培养,检验α-1,3GT基因的稳定性和酶活性的稳定性;人血清结合实验检测A549-GT与IgM和补体C3结合情况。结果RT-PCR检测到转基因细胞系A549-GT中有α-1,3GTmRNA表达。荧光显微镜和流式细胞术检测结果显示:A549-GT能够长期稳定表达异种移植抗原α-gal表位;A549-GT与其亲本细胞在生长形态及增殖速度上无明显差异;A549-GT细胞及其培养基分别与正常人胚肺成纤维细胞MRC-5共培养均不能使MRC-5获得α-gal合成能力;经人血清处理后,荧光免疫实验观察到转基因细胞系A549-GT能与血清抗体IgM结合并诱导补体C3结合。结论异种移植抗原α-gal在肿瘤细胞上的重新表达,可能通过补体依赖的细胞毒机制,介导类似于异种器官移植排斥反应的抗肿瘤效应。
- 朱圣明谢玲郑鸿秦凤刘美骆志国王艳萍
- 关键词：异种抗原A549细胞
- 中国近交系版纳微型猪α1,3-半乳糖基转移酶基因剪接变异体的克隆及其在人类细胞中的表达被引量：2
- 2012年
- 目的克隆中国近交系版纳微型猪(Chinese Banna Minipig Inbred Line,BMI)的α1,3-半乳糖基转移酶(α1,3-GT)基因并分离其剪接变异体,构建其真核表达载体并观察BMIα1,3-GT基因在人肺腺癌A549细胞中的表达和功能。方法提取BMI肝组织总RNA,RT-PCR扩增全长的α1,3-GTcDNA,并克隆到pMD18-T载体,挑选15个阳性克隆进行测序,获得GT1、GT2两种基因剪接变异体。将GT1、GT2克隆到pEGFP-N1上构建其真核表达载体,分别命名为pN-GT1、pN-GT2。将pN-GT1、pN-GT2分别转染人肺腺癌A549细胞,RT-PCR检测转染细胞中α1,3-GT mRNA的表达,倒置荧光显微镜和流式细胞术观察转染细胞上α-半乳糖基(α-Gal)的表达,流式细胞术检测人血清中IgM抗体和补体C3与转染细胞上α-Gal的结合。结果在BMI中发现了碱基长度为1116bp和1080bp的两个α1,3-GT基因剪接变异体,后者缺失了外显子5。pN-GT1或pN-GT2转染的A549细胞中,均检测到了α1,3-GT mRNA和α-Gal的表达,转染细胞膜上也检测到IgM和C3的沉积,且两种转染细胞中α-Gal的表达及IgM和C3的沉积没有差异(P>0.05)。结论成功克隆了BMI的α1,3-GT基因,并发现两种α1,3-GT基因剪接变异体。两种基因剪接变异体转染的细胞中,均检测到α1,3-GT mRNA的表达且α1,3-GT能催化合成具有生物学效应的α-Gal,这为BMI用于异种移植中涉及α1,3-GT基因操作的研究提供了基因背景资料。
- 刘美朱圣明郑鸿王宇王竹杨娅君伍艳霞曾养志王艳萍
- 关键词：异种移植Α1,3-半乳糖基转移酶
