李红亮
- 作品数：4 被引量：9H指数：2
- 供职机构：重庆理工大学药学与生物工程学院更多>>
- 发文基金：国家科技重大专项重庆市自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- 不同启动子对重组毕赤酵母高密度表达人胰岛素前体的影响
- 胰岛素是FDA批准的第一个用于人类的基因重组药物。最初的重组表达是通过大肠杆菌分别表达出胰岛素的A链和B链。现在，胰岛素作为重组蛋白产品，主要有两条途径获得。一条途径是在大肠杆菌中表达胰岛素前体的包涵体，通过溶解和复性等...
- 李红亮
- 关键词：胰岛素发酵毕赤酵母启动子
- 文献传递
- 应用双启动子共表达体系提高人胰岛素原在毕赤酵母中的表达量被引量：7
- 2012年
- 目的应用AOX1和GAP双启动子共表达体系提高人胰岛素原在毕赤酵母中的表达量。方法用限制性内切酶EcoRⅠ和NotⅠ双酶切pMD18-T-HMPIDesB30质粒,回收含短C肽AAK并去掉B链第30位苏氨酸(T)的人胰岛素原类似物HMPIDesB3(0Human mini-proinsulin des B30)片段,插入pGAPZαA载体中,构建重组质粒pGAPZαA-HMPIDesB30,电转化至经质粒pPIC9K-HMPIDesB30异位整合的胰岛素原分泌菌株FJ-H(1pPIC9K-HMPIDesB30/GS115)中,应用抗生素法筛选高表达菌株,并进行发酵试验。结果重组质粒pGAPZαA-HMPIDesB30经双酶切及测序证实构建正确;经Zeocin筛选获得高表达量菌株FJ-H3。经30 L发酵罐发酵,FJ-H3菌株人胰岛素原的表达水平可达1.6 g/L,分别为FJ-H1菌株的1.6倍,FJ-H2菌株(pGAPZαA-HMP-IDesB30/GS115)的5.3倍;经质谱分析,胰蛋白酶酶切后的目的蛋白相对分子质量与理论值相符。结论利用AOX1和GAP双启动子在毕赤酵母中高效表达了人胰岛素原类似物HMPIDesB30,为实现胰岛素的规模化制备奠定了基础。
- 李红亮陈勇陈海容黄程冯一建梅翔何跃范开
- 关键词：胰岛素原毕赤酵母启动子
- 重组人角质细胞生长因子-Ⅰ的聚乙二醇修饰及体外活性被引量：1
- 2012年
- 研究大肠杆菌表达的重组人角质细胞生长因子-Ⅰ型N端缺失突变体(△N23KGF-Ⅰ)的mPEG-马来酰亚胺(mPEG-maleimide、mPEG-Mal)修饰工艺及修饰位点和初步体外生物活性。首先修饰得到聚乙二醇化的△N23KGF-Ⅰ,然后对△N23KGF-Ⅰ作还原和非还原质量肽图,确定其各肽段,对△N23KGF-Ⅰ-m PEG-Mal-20K做还原质量肽图,确定修饰位点。最后,通过BAF-3细胞对△N23KGF-Ⅰ国际标准品、△N23KGF-Ⅰ、△N23KGF-Ⅰ-m PEG-Mal-20K测活。结果表明,在尿素环境下,mPEG-MAl被均一修饰在△N23KGF-I的Cys40位。与国际活性标准品相比,△N23KGF-Ⅰ的活性保留了116%,△N23KGF-Ⅰ-m PEG-Mal-20K的活性保留了36%。
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- 关键词：聚乙二醇修饰
- 重组可逆转水蛭素制备及活性测定
- 2012年
- 将重组可逆转水蛭素(G4-HV1)的cDNA序列插入工程质粒pPIC9K,构建表达质粒pPIC9K-G4-HV1,并电转至毕赤酵母GS115;然后进行高表达筛选,表达后的菌液经离心、纯化得到了纯度95%以上的G4-HV1;最后通过生色底物法测定G4-HV1抗凝活性约为14 000ATU。与凝血酶结合的动力学实验表明,G4-HV1可被凝血酶逆转,可逆转率为30%～40%。
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- 关键词：水蛭素可逆转活性
