刘永亮
- 作品数：10 被引量：33H指数：4
- 供职机构：第三军医大学新桥医院更多>>
- 发文基金：重庆市自然科学基金国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 兔骨髓间充质干细胞获取与特性的实验研究
- 2008年
- 目的:完善兔骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)体外扩增培养体系并观测其特性。方法:兔骨髓经密度梯度离心获得单核细胞后贴壁培养,光镜、透射电镜观察所获细胞形态,流式细胞术检测细胞周期,体外诱导MSCs向成骨细胞、成脂肪细胞分化并鉴定。结果:原代及传代MSCs为漩涡状贴壁生长的长梭形成纤维细胞样细胞,传代细胞具有类似的生长规律;透射电镜示所获细胞具有较强的自我更新能力;细胞周期分析显示87%以上细胞处于G0/G1期;MSCs经体外诱导可向成骨细胞、成脂肪细胞分化。结论:利用密度梯度离心联合贴壁培养法可分离、纯化MSCs,所获细胞具备成体干细胞特性,于体外可大量扩增,做为种子细胞和载体细胞满足实验需要。
- 刘永亮叶钢方针强
- 关键词：细胞培养间充质干细胞骨髓
- 人BMP-7基因重组腺病毒的构建与鉴定被引量：9
- 2008年
- 目的构建含有人骨形态发生蛋白-7(bone morphogenetic protein-7,BMP-7)基因的重组腺病毒载体,并对其相关指标进行鉴定,观察其对肾小管上皮细胞株(HKC)细胞的转染情况。方法用基因工程技术将人BMP-7基因cDNA亚克隆至穿梭质粒pDC316上,利用脂质体介导的方法将AdMax腺病毒包装系统的骨架质粒pBHGlox_E1,3Cre和穿梭质粒pDC316-BMP-7转染入HEK293细胞,进行同源重组,得到腺病毒重组质粒Ad5-BMP-7,并在其中包装扩增病毒。采用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定,利用穿梭质粒中所带绿色荧光蛋白GFP报告基因,进行病毒滴度的测定和对HKC细胞感染效率的检测。结果酶切鉴定及PCR结果证明BMP-7基因重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度达1.25×1010PFU/ml,对HKC有较强感染能力。结论应用细胞内同源重组方法成功构建了含人BMP-7基因的重组腺病毒载体。
- 方针强叶钢欧阳一辛刘永亮贾维胜冯嘉瑜
- 关键词：腺病毒骨形成蛋白-7同源重组
- hBMP-7修饰的骨髓间充质干细胞对肾脏BMP-7的影响被引量：6
- 2011年
- 目的观察人骨形态发生蛋白-7(hBMP-7)基因修饰的骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)移植对缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury,IRI)肾脏内源和外源BMP-7表达的影响,探讨其对IRI肾脏的保护作用。方法 45只兔采用随机数字表的方法分为对照组(Ⅰ组)、单纯BM-MSCs移植组(Ⅱ组)和基因修饰的BM-MSCs移植组(Ⅲ组)(n=15)。构建hBMP-7重组腺病毒并转染兔BM-MSCs,建立肾脏IRI模型后,移植组于肾血流恢复后经肾动脉推注单纯和基因修饰的自体BM-MSCs,对照组同法推注等量生理盐水。3组分别于术后3、7、14 d采用随机数字表的方法取5只兔经耳缘静脉采血,检测血清肌酐(Crea)和尿素(Urea),观察肾功能情况;同时取肾组织进行HE染色行肾小管损伤评分,ELISA和RT-PCR法分别检测肾脏hBMP-7和BMP-7的蛋白浓度和mRNA表达。结果肾脏IRI后3、7、14 d,Ⅲ组Crea和Urea明显低于Ⅰ组和Ⅱ组(P<0.05);Ⅲ组肾小管损伤评分均低于Ⅰ组和Ⅱ组(P<0.05);Ⅲ组检测到第3、7、14天hBMP-7蛋白[(81.8±25.5)、(107.8±33.4)、(49.6±17.8)pg/mg]和mRNA(0.82±0.12、0.69±0.13、0.42±0.10)的表达并维持至少2周;Ⅲ组第3、7、14天BMP-7 mRNA(1.08±0.33、1.36±0.17、1.64±0.21)和BMP-7蛋白(95.9±21.3、137.0±14.9、192.1±18.0)的表达均高于Ⅰ组和Ⅱ组(P<0.05)。结论 hBMP-7基因修饰的BM-MSCs移植既能携带外源性hBMP-7在缺血再灌注损伤肾脏中表达,又能提高内源性BMP-7的表达,减轻肾脏损伤,促进肾脏修复,改善肾脏功能。
- 方针强刘永亮王祥卫易善红贾维胜陈伟何凡沈崇星叶钢
- 关键词：骨形态发生蛋白-7骨髓间充质干细胞肾脏缺血再灌注损伤
- 兔自体骨髓间充质干细胞移植对冷缺血再灌注损伤肾脏细胞增殖与凋亡和肾功能的影响被引量：3
- 2009年
- 目的:建立兔肾脏冷缺血再灌注损伤(Ischemia-reperfusion injury,IRI)模型,观察经肾动脉灌注移植的自体骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)对IRI肾脏细胞增殖与凋亡的影响,探讨其保护作用机制。方法:45只兔随机均分为假手术组(Ⅰ组)、对照组(Ⅱ组)和移植组(Ⅲ组)(n=15)。分离移植组兔BM-MSCs,建立肾脏IRI模型后,移植组于肾血流恢复后经肾动脉推注自体BM-MSCs,对照组和假手术组同法推注等量生理盐水。分别于术后3、7、14d3组各随机取5只经耳缘静脉采血,检测血清肌酐(Crea)和尿素(Urea),观察肾功能情况;同时取肾组织进行增殖细胞核抗原(PCNA)、Bcl-2、Bax免疫组化染色,TUNEL法检测肾脏凋亡细胞,计算Bcl-2、Bax含量和肾小管上皮细胞增殖指数(Proliferating cell nuclearantigen index,PI)和凋亡指数(Apoptosisindex,AI)。结果:IRI后第3d移植组和对照组兔Crea和Urea均达到最高水平[移植组:(297.9±18.6)μmol/L,(19.2±1.5)mmol/L;对照组:(326.6±20.0)μmol/L,(22.6±2.6)mmol/L],以后逐渐下降,到第14d,移植组Crea和Urea分别为(224.1±19.2)μmol/L,(13.9±1.6)mmol/L;对照组Crea和Urea分别为(278.6±16.9)μmol/L,(17.4±1.0)mmol/L,各时间点移植组Crea和Urea明显低于对照组(P<0.05)。各时间点移植组Bcl-2含量和肾小管上皮细胞PI高于对照组,Bax含量和肾小管上皮细胞AI低于对照组,两组间差异有统计学意义(P<0.05)。结论:BM-MSCs移植能促进肾脏I/R损伤后肾脏细胞增殖,抑制肾脏细胞凋亡,从而降低血清Crea和Urea,在一定程度上促进IRI后肾功能的恢复。
- 方针强叶钢刘永亮周韬易善红邹旭东
- 关键词：骨髓间充质干细胞肾脏缺血再灌注损伤
- 肢体缺血预处理对兔肾急性缺血再灌注损伤的保护作用被引量：6
- 2008年
- 目的观察肢体缺血预处理对肾脏急性缺血再灌注损伤(IRI)能否产生保护作用,并通过肾功能、组织病理学等检测评估其效果。方法(1)建模:40只新西兰大白兔随机分为3个组,假手术(S)组8只,缺血再灌注(IR)组和预处理(LIP)组各16只,后2个组兔采用右肾切除、左肾动静脉阻断1h开放法建立肾脏缺血再灌注模型,S组仅切除右肾,游离左肾动静脉但不阻断。(2)肢体缺血预处理方法:LIP组在阻断前,先以止血带在双下肢根部绑扎,阻断血流5min,完全开放10min,反复4次。(3)评估指标:对比各组兔在再灌注后8、24h和3、7d时肾功能、肾组织MDA含量和SOD活性以及组织病理学差异。结果LIP组再灌注后血清Scr和BUN升高幅度要明显低于IR组(P<0.05),在再灌注后3d内血Scr和BUN明显低于IR组(P<0.05);LIP组再灌注后24h内SOD活性和MDA含量的变化幅度明显低于IR组(P<0.05),且在各时间点SOD活性均明显高于IR组(P<0.05),MDA含量均明显低于IR组(P<0.05);LIP组光镜下病理改变轻于IR组。结论肢体缺血预处理能减轻肾脏缺血再灌注引起的组织病理改变,降低肾组织MDA含量并增加SOD活性,改善肾功能,对急性肾脏IRI起到明显的保护作用。
- 方针强叶钢刘永亮贾维胜肖亚
- 关键词：肾脏肢体缺血预处理缺血再灌注损伤
- BMP7和EGFP重组腺病毒体外转染兔骨髓间充质干细胞的研究被引量：3
- 2008年
- 目的观测体外培养的兔骨髓间充质干细胞生物学特性,并转染重组腺病毒Ad5-EGFP-BMP7,观察BMP7与EGFP的表达情况。方法通过密度梯度离心联合贴壁法,分离、纯化间充质干细胞;流式细胞仪检测细胞周期和表面标记;体外诱导间充质干细胞向成骨细胞、成脂肪细胞分化并鉴定。转染后,荧光显微镜及免疫细胞化学染色检测外源基因的表达。结果原代及传代间充质干细胞为成纤维细胞样细胞;87%以上处于G0/G1期;CD44表达阳性,CD45表达阴性;经成骨细胞诱导后,碱性磷酸酶染色阳性,并有矿化结节形成;经成脂肪细胞诱导后,细胞内出现大量脂滴。转染Ad5-EGFP-BMP7后,荧光显微镜下可见EGFP表达阳性;免疫细胞化学染色显示细胞内BMP7表达阳性。结论成功分离、纯化间充质干细胞,并鉴定其具有成体干细胞特性;重组腺病毒介导BMP7和EGFP体外成功转染间充质干细胞,并稳定表达BMP7、EGFP,为下一步实验奠定了基础。
- 刘永亮叶钢易善红方针强张英晨
- 关键词：骨髓间充质干细胞骨形态发生蛋白7增强型绿色荧光蛋白
- 白细胞介素-10基因修饰对骨髓间充质干细胞体外免疫效应的影响
- 2013年
- 目的:研究白细胞介素-10(interleukin-10,IL-10)基因修饰的骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)体外免疫效应。方法:RT-PCR克隆大鼠IL-10基因并构建逆转录病毒pLNCX-IL-10,转染大鼠BMMSCs;流式细胞仪检测IL-10基因修饰的BMMSCs(BMMSCs IL-10)体外对T淋巴细胞亚群的影响,CCK-8法检测BMMSCs IL-10及其培养上清液对体外混合淋巴细胞增殖的影响。结果:BMMSCsIL-10能明显减少CD4+T,降低CD4+/CD8+比值,比BMMSCs作用明显(P=0.000);BMMSCsIL-10及其培养上清液比BMMSCs更能明显抑制T淋巴细胞增殖反应(P=0.000)。结论:IL-10基因修饰能增强BMMSCs的体外免疫抑制作用。
- 方针强戴玮贾维胜何凡沈崇星刘永亮周锋叶钢
- 关键词：骨髓间充质干细胞白细胞介素-10免疫抑制
- 低功率超声辐照微泡造影剂对大鼠前列腺内伊文思蓝浓度的影响被引量：2
- 2014年
- 目的探讨低功率超声辐照微泡造影剂提高前列腺内的药物浓度的价值。材料与方法选取成年远交群(SD)雄性大鼠60只,按抽签法分为对照组、伊文思蓝(EB)组、微泡组、同时辐照组及先行辐照组,每组各12只。对照组给予生理盐水10 ml/kg;EB组给予EB 50 mg/kg;微泡组给予微泡造影剂0.1 ml/kg;同时辐照组先给予EB 50 mg/kg,超声辐照5 min后,再给予微泡造影剂0.1 ml/kg;先行辐照组给予微泡造影剂0.1 ml/kg后,超声局部间歇辐照前列腺5 min,30 min再给予EB 50 mg/kg。实验结束后取前列腺组织进行病理观察,并制备前列腺组织匀浆测量EB浓度。结果 EB组大鼠前列腺内EB浓度高于对照组及微泡组,差异有统计学意义(t=4.157、4.357,P<0.01);同时辐照组大鼠前列腺内EB浓度高于EB组,差异有统计学意义(t=2.438,P<0.05);先行辐照组大鼠前列腺内EB浓度明显低于同时辐照组,差异有统计学意义(t=2.761,P<0.05);先行辐照组与EB组EB浓度差异无统计学意义(t=0.684,P>0.05)。结论低功率超声联合微泡造影剂可以明显提高前列腺组织EB药物浓度。
- 陈江川刘永亮刘政叶钢易善红
- 关键词：前列腺造影剂微泡伊文思蓝
- 兔骨髓间充质干细胞培养与多向分化潜能鉴定的实验研究被引量：7
- 2008年
- 目的原代培养兔骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs),观察体外培养中MSCs的生物学特性及多向分化潜能。方法通过密度梯度离心联合贴壁培养法,体外分离、纯化、扩增兔骨髓间充质干细胞,观察形态学特点,测绘传代MSCs生长曲线,检测细胞周期及表面标记,体外诱导MSCs向成骨细胞、成脂肪细胞分化并鉴定。结果原代及传代MSCs为长梭形成纤维细胞样细胞;生长曲线显示传代细胞具有类似的生长规律;流式细胞仪分析MSCs CD44表达阳性,CD45表达阴性;细胞周期分析显示87%以上细胞处于G0/G1期;经成骨细胞诱导,细胞碱性磷酸酶染色阳性;经成脂肪细胞诱导,细胞内出现红染脂滴。结论通过密度梯度离心联合贴壁培养法可大量扩增、纯化MSCs,所获细胞具有高度自我更新和多向分化潜能。
- 刘永亮叶钢方针强
- 关键词：间充质干细胞骨髓细胞培养多向分化
