王亚欣
- 作品数：12 被引量：23H指数：3
- 供职机构：中国农业科学院上海兽医研究所更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家生猪现代产业技术体系建设项目国家高技术研究发展计划更多>>
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- 表达猪瘟病毒E2蛋白重组猪繁殖与呼吸道综合征病毒的研究被引量：3
- 2012年
- 为构建表达猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白重组猪繁殖与呼吸道综合征病毒(PRRSV),本研究首先利用高致病性PRRSV弱毒疫苗HuN4-F112株的感染性分子克隆作为平台,构建了一个在nsp2区有缺失的感染性分子克隆,命名为pHuN4-F112-△480-620。以pHuN4-F112-△480-620作为载体,采用突变PCR的方法将CSFV的主要保护性抗原E2基因1 bp～9 99 bp,1 bp～600 bp,1 bp～330 bp及256 bp～330 bp基因片段分别插到nsp2中aa 480～aa 620位氨基酸缺失编码区域。结果显示,插入完整E2基因或较大E2基因片段的重组PRRSV cDNA质粒均未能拯救出病毒,只有插入较小的E2基因片段(256 bp～330 bp)的重组病毒cDNA质粒成功地拯救出了重组病毒rPRRSV-F112-E2(256-330),拯救的病毒能够在MARC-145细胞上引起明显的细胞病变,而且生长速度明显高于其亲本病毒,间接荧光检测表明该重组病毒能够表达外源基因。
- 童武周艳君徐彦召姜一峰王亚欣张善瑞朱建平虞凌雪孙晶陈焕春童光志
- 关键词：猪繁殖与呼吸道综合征病毒猪瘟病毒感染性分子克隆重组病毒
- 不同致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒感染猪体内不同时相PBMCs细胞的动态变化与分析
- 引言/目的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染后可以引起机体出现急性感染期,其后又可以导致病毒的持续性感染,而高致病性PRRSV可导致猪体在急性感染期内死亡,为了揭示PRRSV在急性感染期内免疫逃避的分子机理,本研究...
- 王亚欣周艳君徐彦召童武朱建平姜一峰童光志
- 不同致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒感染猪体内不同时相PBMCs细胞的动态变化与分析
- 为了揭示PRRSV在急性感染期内免疫逃避的分子机理，本研究采用高致病性PRRSV强毒HuN4株及其弱毒疫苗HuN4-F112株分别感染实验动物，分离试验感染猪的外周血淋巴细胞(PBMCs)，采用流式细胞分析的方法，对感染...
- 王亚欣周艳君徐彦召童武朱建平姜一峰童光志
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒感染免疫逃避致病机理
- 高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白Nsp4的表达及其抗血清的制备被引量：1
- 2009年
- 根据GenBank中已发表的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(Highly Pathogenic Porcine Reproductiveand Respiratory Syndrome Virus,PRRSV)HuN4株全基因组序列,设计合成一对引物,对PRRSV HuN4株非结构蛋白Nsp4(Nonstructural protein4基因进行RT-PCR扩增,克隆到原核表达载体pET30a(+)中,构建重组表达载体pET30a-Nsp4,经酶切测序鉴定。将pET30a-Nsp4转化表达菌株BL21(DE3),诱导可表达分子量约为27kDa重组蛋白。Western blot显示其具有较好的反应原性,经镍离子亲和层析(Ni-NTA)纯化获得了高纯度的可溶性重组蛋白。将纯化的Nsp4蛋白免疫BALB/c小鼠,抗血清ELISA效价达1∶16 000,Western blot和IFA表明,所制备的抗血清能够特异性识别PRRSV自身表达的Nsp4蛋白。本研究获得了可溶性的PRRSV Nsp4蛋白,制备了Nsp4特异性多抗血清,为进一步研究Nsp4蛋白的亚细胞定位及功能奠定了基础。
- 许傲天周艳君李国新于海闫丽萍陈宗艳张善瑞王礞礞姜一峰王亚欣田志军童光志
- 关键词：高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP4原核表达
- 猪流行性腹泻病毒N基因的表达及抗原性分析被引量：10
- 2013年
- 为深入了解仔猪腹泻的病因,本研究在不同发病猪场采集了115份临床样品,通过RT-PCR方法对猪流行性腹泻病毒(PEDV)进行检测,结果显示总阳性率为81.7%。进一步从部分样品中对PEDV的N基因进行克隆和序列分析,结果显示采集的临床样品中各分离株之间的氨基酸同源性高达99%以上,与代表性病毒株CV777的氨基酸同源性为97.4%～98.1%,表明目前流行的PEDV其N基因仍然相对保守的。同时,构建了重组表达载体pGEX-N,经诱导表达显示该重组蛋白呈可溶性表达,重组蛋白大小约为81 ku,western blot分析结果表明该重组蛋白能够被PEDV阳性猪血清特异性识别。将纯化后的重组N蛋白作为包被抗原,对20份已知背景的临床猪血清抗体进行ELISA检测,结果显示有9份血清为抗体阳性,11份血清呈抗体阴性,与应用RT-PCR方法鉴定抗原的结果符合率为85%。本研究表达的重组N蛋白具有良好的抗原性,可以将其作为PEDV血清学诊断的候选抗原。
- 吴玉璐朱建平杨莘王亚欣徐彦召虞凌雪于海刘光清童光志周艳君
- 关键词：猪流行性腹泻病毒重组N蛋白抗原性分析
- 高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白NSP4的原核表达及其抗体的制备
- 猪繁殖与呼吸综合征病毒是不分节段的单股正链RNA病毒,基因组大小约为15kb.通过与马动脉炎病毒氨基酸序列比较分析,认为PRRSV的非结构蛋白NSP4具有3C样丝氨酸蛋白酶活性,是参与病毒多聚蛋白前体加工的主要蛋白酶。本...
- 许傲天周艳君李国新于海闫丽萍陈宗艳张善瑞王礞礞姜一峰王亚欣童光志
- 关键词：NSP4原核表达多克隆抗体
- 文献传递
- 高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒强弱毒ORF1a、ORF1b、ORF2-ORF7片段互换嵌合病毒的构建及其生物学特性的分析被引量：3
- 2012年
- 为研究高致病性猪繁殖和呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)强弱毒之间毒力差异的分子基础,本实验分别以HP-PRRSV强毒HuN-F5株及其传代致弱的疫苗病毒株HuN4-F112为亲本病毒,利用反向遗传操作技术分别将ORF1a、ORF1b或ORF2-7编码序列在强弱毒之间互换。将6种含有不同嵌合基因的全长病毒基因组的重组质粒体外转录后转染BHK-21细胞,然后在Marc-145细胞中传代,拯救的重组病毒经RT-PCR、测序和免疫荧光鉴定,并分别命名为rHuN4-F5-ORF1a、rHuN4-F5-ORF1b、rHuN4-F5-ORF2-7(以强毒为骨架)和rHuN4-F112-ORF1a、rHuN4-F112-ORF1b、rHuN4-F112-ORF2-7(以弱毒为骨架)。进一步测定这些病毒在Marc-145上的生长曲线,结果显示:以强毒为骨架的嵌合病毒rHuN4-F5-ORF1a生长滴度显著高于亲本强毒rHuN4-F5,而以弱毒为骨架的嵌合病毒rHuN4-F112-ORF1a在细胞上的生长滴度低于其亲本弱毒rHuN4-F112,其他片段替换对病毒在细胞上的生长没有明显影响。本实验结果提示ORF1a对于PRRSV在体外细胞培养上的生长调节起重要作用。
- 姜一峰周艳君王亚欣朱建平徐彦召童武虞凌雪童光志
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒嵌合病毒
- 表达O型口蹄疫病毒保护性抗原表位重组PRRSV的构建及其鉴定被引量：5
- 2012年
- 以高致病性猪繁殖与呼吸综合征弱毒疫苗的感染性分子克隆（rHuN4-F112）作为载体，将O型口蹄疫病毒（FMDV）VPl基因的421～480nt（141～160aa）和598～639nt（200～213aa）两优势保护性抗原表位串联成的目的基因，通过突变PCR的方法插入Nsp2中的508～532位缺失区域，经体外转录后转染至BHK-21细胞中培养36h，将上清接种至MARC-145细胞中培养，并在MARC-145细胞中连续传代，拯救重组病毒。经RT-PCR扩增，MluI酶切及测序验证，结果表明插入的外源基因及人为突变的Mlu1分子标记都正确，说明重组病毒拯救成功，且该重组病毒能够在MARC-145细胞中稳定传代，将此重组病毒命名为rPRRSV-F112-O／VPlep。rPRRsv-F112-O／VPlep能够在MARC-145细胞上引起明显的细胞病变，间接免疫荧光检测表明外源基因在该病毒中成功获得了表达。经过生物学特性分析，该病毒的TCID50=-log10-6.75／0．1mL，且在MARC-145细胞中整体生长速度与其亲本病毒rHuN4-Fll2（△508-532）相似，但明显高于rHuN4-F112病毒。
- 童武徐彦召周艳君姜一峰张善瑞王亚欣朱建平虞凌雪孙晶陈焕春童光志
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合症病毒O型口蹄疫病毒感染性分子克隆重组病毒
- 猪繁殖与呼吸综合征病毒强/弱毒株感染PAMs细胞差异表达蛋白的鉴定
- 引言 高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)目前仍然是我国养猪业的严重威胁,在PRRSV强、弱毒株之间存在着明显的致病性差异,但其机理尚不清楚.本研究我们将PRRSV强毒HuN4株和弱毒疫苗株HuN4-F 1...
- 朱建平王亚欣程群虞凌雪姜一峰周艳君童光志
- 猪繁殖与呼吸综合征病毒强/弱毒感染PAM细胞生物学特性比较分析被引量：1
- 2012年
- 为了解猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)强、弱毒株在PAM细胞上的增殖特性,本研究在体外分离培养了健康猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages,PAM),然后分别用高致病性PRRSV强毒HuN4株和弱毒疫苗HuN4-F112株感染PAM细胞,细胞病变观察和间接免疫荧光检测结果显示,二者在体外均可以感染PAM细胞,其中强毒HuN4株感染PAM细胞CPE较为明显。在两个毒株感染PAM细胞后12、24、36、48、60h分别收获病毒感染的细胞,利用抗PRRSV N蛋白单抗进行Western blot分析检测病毒核蛋白在不同时间表达量的变化,结果表明,强毒株在感染PAM细胞的早期,N蛋白合成表达量明显高于弱毒疫苗株,而弱毒疫苗株在感染Macr-145细胞早期,N蛋白的合成量则明显优于强毒株。比较HuN4株与HuN4-F112株在PAM细胞和Marc-145细胞的生长曲线,结果显示强、弱毒在PAM细胞和Marc-145细胞生长趋势存在明显差异,其中强毒HuN4株在PAM细胞上增殖能力明显强于弱毒株,而弱毒HuN4-F112株在Marc-145细胞上的增殖能力明显强于其在PAM细胞上的增殖能力,表明PRRSV强毒株对靶细胞PAM的感染能力较强,弱毒疫苗株对其感染能力相对较弱。本研究为深入了解PRRSV强毒株与弱毒疫苗株的致病性差异提供了理论依据。
- 朱建平周艳君王亚欣虞凌雪吴玉璐童武姜一峰朱礼倩于海童光志
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒肺泡巨噬细胞生物学特性
