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李文辉: 作品数：11 被引量：47H指数：5; 供职机构：中国医学科学院北京协和医学院基础医学院基础医学研究所更多>>; 发文基金：国家高技术研究发展计划卫生部科技专项基金北京市自然科学基金更多>>; 相关领域：医药卫生生物学更多>>

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一种重组复制缺陷型腺病毒载体狂犬病毒基因工程疫苗: 本发明提供了一种重组复制缺陷型腺病毒载体狂犬病毒基因工程疫苗，它是以E1、E3联合缺失的复制缺陷型人腺病毒为载体，在E1区携带有狂犬病毒包膜糖蛋白编码基因及调控其进行高效表达的元件，所述的狂犬病毒包膜糖蛋白编码基因来自强...; 王树惠李文辉; 文献传递

快速构建腺病毒载体的新方法被引量：5: 1999年; 近年来，随着腺病毒载体广泛应用于实验性基因治疗等生物学研究领域，构建重组腺病毒的方法也有了很大改进，本文主要介绍两种快速构建人腺病毒载体的新方法：1．用DNA-末端蛋白质复合物构建重组腺病毒。2在大肠杆菌细胞内而非真核细胞内完成通过同源重组产生重组腺病毒核酸的过程。; 李文辉; 关键词：腺病毒载体基因治疗

用大肠杆菌同源重组获得克隆化重组腺病毒基因组被引量：9: 2000年; 利用大肠杆菌细胞内质粒间同源重组获得克隆化重组腺病毒基因组 DNA,高效构建携带有外源基因的均一重组腺病毒 .将带有狂犬病毒糖蛋白 (GP)基因和加强型 GFP(enhanced GFP,EGFP)表达盒的重组穿梭质粒 p Ad- Track- CMV/ GP与腺病毒骨架载体质粒 p Ad Easy- 1一起同时电击共转化大肠杆菌 BJ51 83.在 BJ51 83细胞内 ,带有同源序列的重组穿梭质粒与骨架载体可进行同源重组 ,得到以质粒形式存在的克隆化重组腺病毒基因组 p Ad- GP’.以 p Ad- GP’为模板 ,经DNA测序确认 GP基因成功整合入此质粒中的腺病毒基因组 E1区外源基因表达盒中 .线形化的p Ad- GP’转染 2 93细胞后可得到基因组结构均一、在 E1区插入有 GP和 EGFP表达盒的重组腺病毒 ,病毒滴度可达 1× 1 0 8pfu/ ml.电镜下此重组病毒颗粒直径约为 70 nm,略呈球形 ,用荧光显微镜观察感染细胞有很强的 EGFP表达 .实验表明 :利用大肠杆菌同源重组获得克隆化的重组腺病毒基因组 DNA。; 李文辉王树蕙张云刘力public.east.cn.net; 关键词：大肠杆菌同源重组重组腺病毒腺病毒载体

小鼠对表达狂犬病毒3aG株糖蛋白的重组复制缺陷型腺病毒的免疫应答被引量：9: 2001年; 目的　研究表达狂犬病毒 3aG株糖蛋白 (GP)的重组复制缺陷型腺病毒Ad/GP′及Ad/GP免疫小鼠后所产生的特异性体液免疫应答 ,体外脾细胞增殖反应 ,及免疫小鼠对狂犬病毒致死性颅内攻击的保护力。方法　 1× 10 7pfu重组病毒经腹腔对小鼠进行基础和加强免疫 ,以快速荧光灶抑制实验 (RFFIT)方法测定小鼠血清狂犬病毒特异性中和抗体滴度 ,[3H]TdR掺入DNA法测定体外脾细胞增殖反应 ;小鼠致死性CVS狂犬病毒颅内攻击测定重组病毒免疫对小鼠的保护效果。结果　RFFIT方法测定免疫小鼠血清中和抗体滴度分别为Ad/GP :0 75IU/ml,Ad/GP’ :2 6IU/ml;[3H]TdR掺入法测定重组病毒免疫组小鼠脾细胞体外受到特异GP抗原刺激后 ,增殖增强 2倍以上 ;86 7%的Ad/GP′免疫小鼠及 6 6 7%的Ad/GP免疫小鼠可抵抗约 30LD50 CVS狂犬病毒的颅内攻击。; 李文辉张云王树蕙刘力; 关键词：重组腺病毒狂犬病毒免疫应答

狂犬病毒CVS-N2c毒株糖蛋白基因的克隆和重组腺病毒的构建被引量：10: 2003年; 克隆了狂犬病毒CVS N2c毒株糖蛋白 (GP)基因 ,并进行了GP全基因序列测定和对比分析。结果显示CVS N2cGP基因编码区长 15 75bp ,编码 5 2 4个氨基酸 ,与国内外发表的狂犬病毒疫苗株 3aG株、ERA株、和HEP Flury株GP基因的核酸序列同源性分别为 89 0 % ,89 3% ,94 5 % ,而推导的氨基酸序列同源性分别为 87 6 %、88 4 %、和91 2 %。在此基础上 ,用pAdEasy载体系统构建了表达GP基因的重组腺病毒。电镜下确定重组病毒颗粒的直径约70nm ,Westernblot显示重组病毒表达的GP蛋白可被兔抗狂犬病毒血清识别 ,表达的GP蛋白分子量约为 6 6kD ,与天然的狂犬病毒GP的分子量相符。该表达CVS N2c毒株GP基因的重组腺病毒是筛选有效狂犬病毒基因工程疫苗的基础。; 张云李文辉王树惠刘力杨帆; 关键词：狂犬病毒基因序列测定重组腺病毒狂犬病

表达Cre酶复制缺陷型重组腺病毒载体的构建及鉴定: 2006年; 目的构建Cre-loxP条件性基因敲除系统中Cre酶的重组腺病毒表达载体,作为体细胞条件性基因敲除的基础,并为传统ES细胞条件性基因敲除提供新的选择。方法用pAd-easy系统在大肠杆菌内经同源重组的方法构建Cre酶的复制缺陷型重组腺病毒载体;W estern b lot方法鉴定Cre蛋白的表达。结果在大肠杆菌内构建出重组腺病毒质粒,在包装细胞系内包装出重组病毒颗粒;测定病毒滴度为106pfu/L;重组病毒在细胞内表达Cre蛋白。结论表达Cre酶的重组腺病毒载体构建成功,阳性重组质粒的鉴定方法得以改进,为进一步的体细胞Cre-loxP条件性基因敲除提供了基础。; 段素素张云杨帆王颖李文辉王树惠刘力; 关键词：CRE重组酶腺病毒载体

来自噬菌体抗体库识别KG1a细胞的scFv5C1的高效表达、纯化及其生物学特性被引量：3: 2001年; 目的　为深入研究源于噬菌体抗体库特定单链抗体 (scFv)的功能和其识别抗原的分子特征 ,将识别KG1a细胞的单链抗体 5C1scFv高效表达、纯化 ;用scFv测定未知抗原的相对分子质量 (Mr) ;并研究 5C1scFv对KG1a部分细胞生物学特性的影响。方法　基因重组构建表达 5C1scFv的载体pSTE 5C1,在大肠杆菌中诱导表达 ,金属离子螯和亲和层析法纯化 ,获得高纯度的活性 5C1scFv ;借助生物素链亲和素的高亲和力和高灵敏度的显色系统 ,用Westernblot分析其识别的KG1a细胞膜蛋白的Mr;用聚集实验分析 5C1scFv对KG1a细胞同型聚集的影响。结果　 5C1scFv在大肠杆菌中获高效表达 ,纯化后活性蛋白产量可达每升培养物 5 0～ 6 0mg ,纯度大于 95 % ;成功地测定了其识别抗原的Mr 为 (85 .0 /12 4.5 )× 10 3;并确认 5C1scFv以浓度依赖方式抑制KG1a细胞的同型聚集。结论　高效表达纯化的 5C1scFv特异性识别Mr 为 (85 .0 /12 4.5 )× 10 3 的KG1a细胞膜表面分子 ,此分子可能是一种在KG1a细胞表面表达的参与细胞同型聚集的分子或受体。; 隋建华李文辉姜学英何一心宋增璇; 关键词：单链抗体免疫印迹包涵体噬菌体

表达狂犬病毒糖蛋白基因复制缺陷型重组腺病毒的构建及其特性被引量：16: 2003年; 目的构建表达狂犬病毒CVS-N2C毒株糖蛋白(GP)基因的复制缺陷型重组腺病毒,作为筛选狂犬病毒基因工程疫苗的基础。方法用大肠杆菌细胞内同源重组技术构建重组病毒;NorthernblotWesternblot和免疫荧光抗体等方法鉴定重组病毒。结果重组病毒具有典型的病毒形态;病毒基因组稳定;GP基因可被转录;重组病毒表达的GP蛋白相对分子质量为66000,与天然GP相对分子质量相符表达的GP蛋白可被兔抗狂犬病毒免疫血清特异性识别;小鼠免疫-攻击试验可保护87.5%～100%动物。结论成功地构建了表达狂犬病毒CVS-N2C毒株GP基因的复制缺陷型重组腺病毒,并表现了良好的免疫效果。; 李文辉张云王树惠刘力杨帆; 关键词：重组腺病毒狂犬病毒复制缺陷型

狂犬病毒糖蛋白基因重组腺病毒与同一抗原核酸疫苗的联合免疫研究被引量：5: 2002年; 目的　研究联合运用狂犬病毒糖蛋白基因重组腺病毒与同一抗原核酸疫苗对小鼠的免疫效果。方法　构建狂犬病毒糖蛋白 (GP)的真核表达质粒pcDNA3.1 CVS N2cGP作为核酸疫苗 ,瞬时转染COS 7细胞 ,间接免疫荧光试验检测pcDNA3.1 CVS N2cGP的表达 ;以基因枪方法进行初次免疫接种和首次加强免疫 ,以表达同一抗原的复制缺陷型重组腺病毒通过鼻腔接种进行第二次加强免疫 ;ELISA试验检测血清狂犬病毒特异性IgG抗体 ,快速荧光灶抑制试验 (RFFIT)检测狂犬病毒中和抗体。结果　间接免疫荧光试验表明pcDNA3.1 CVS N2cGP能有效地表达GP于转染的细胞膜上 ,ELISA试验表明小鼠接受基因枪核酸免疫后 ,仅诱导产生低水平的特异性抗体 ,而用重组腺病毒进行加强免疫后 ,特异性抗体水平显著提高。结论　联合运用狂犬病毒糖蛋白基因重组腺病毒与同种抗原核酸疫苗可克服它们单独使用时各自的缺点 ,能有效地诱导小鼠产生抗狂犬病毒特异免疫。; 李文辉张云隋建华杨帆郭彩云王树蕙; 关键词：核酸疫苗重组腺病毒联合免疫狂犬病毒狂犬病

基因工程乳腺癌特异性人单链抗体的表达与特性被引量：4: 2002年; 研究解决分泌人单抗的杂交瘤细胞系难于稳定持久分泌抗体的难题 ,制备单链抗体 ,使单抗分子小型化 ,为进一步研究其在肿瘤诊断和治疗中的应用作准备。从分泌抗乳腺癌人单抗的杂交瘤细胞CM 1总RNA中 ,利用RT PCR技术分别扩增出人单抗重链可变区VH 基因和轻链可变区VL 基因 ,将扩增产物纯化后克隆于pGEM T载体中 ,进行DNA测序和序列比较分析后 ,将两者共克隆于表达载体中诱导表达 ,利用斑点免疫印迹及竞争抑制法检测表达产物的抗原性。所克隆的CM 1人单抗重链可变区和轻链可变区基因片段 ,分别属于人免疫球蛋白IgMⅢ亚群 ,和鼠κ轻链V亚群 ,ⅩⅦ家族 ,用斑点免疫印迹法检测可见表达产物能与人乳腺癌细胞特异结合 ;人CM 1单克隆抗体对此单链抗体与人乳腺癌细胞的结合有竞争性抑制作用 ,抑制率为 75 7%。结论成功地制备了可特异结合乳腺癌细胞的CM; 张云王树蕙郭彩云李文辉扬帆; 关键词：基因工程乳腺癌单链抗体

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