张朝春
- 作品数：4 被引量：27H指数：3
- 供职机构：中国科学院微生物研究所更多>>
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- 相关领域：生物学更多>>
- 神经营养素-3基因的人工合成及其在毕赤酵母中的分泌性表达
- 根据人神经营养素-3(Human meurotrohin-3,hNT-3)的基因序列,把编码氨基酸的密码子转换成毕赤酵母(Pichia pastoris)偏爱的形式,设计了10条36bp-59bp的寡聚核苷酸引物,通过5...
- 张朝春
- 关键词：神经营养素-3毕赤酵母偏爱密码子基因合成分泌性表达
- 文献传递
- 一种多拷贝毕赤酵母表达载体的构建及人脑源性神经营养因子的表达被引量：12
- 2005年
- 利用PCR技术扩增出pPIC9K载体的HIS4 Kan序列片段 ,与pPICZα重组 ,构建结合了两个载体特点的适合体外构建多拷贝基因表达盒的毕赤酵母表达载体pPICZα1,改造后的载体含HIS4 Kan序列 ,能整合到酵母染色体上 ,具有筛选方便、外源基因多拷贝组建迅速、蛋白产物分泌表达和易纯化等优点。将人脑源性神经营养因子(hBDNF)的cDNA(35 7bp)克隆入载体pPICZα1,利用同尾酶BglⅡ、BamHⅠ不可逆连接方式 ,分别构建含有 1、2、3、6个拷贝hBDNF表达盒的重组表达载体 ,电击法转化毕赤酵母GS115菌株 ,用G4 18和Zeocin筛选转化子 ,筛选到的阳性转化子用 0 5 %甲醇诱导 ,获得分泌型表达。表达产物类似于天然神经营养因子单体大小、分子量约 14kD。多拷贝hBDNF表达盒的表达水平亦高于单拷贝hBDNF表达盒 ,ELISA和Westernblot检测表明 :表达的蛋白能与鸡抗人脑源性神经营养因子抗体特异结合 。
- 梁伟锋张朝春杨希才
- 关键词：人脑源性神经营养因子毕赤酵母分泌表达
- 专一切割苹果锈果类病毒多体自切割核酶的克隆和转录物的体外活性测定被引量：4
- 2002年
- 将苹果锈果类病毒的 1个 14nt的靶序列连接在锤头型核酶的 3′末端 ,构成自切割核酶。经人工合成和PCR扩增 ,克隆在转录载体pGEM7zf(+)的XhoⅠ HindⅢ位点。利用限制酶XhoI与SalI的连接 ,消失其识别位点序列 ,将自切割核酶片段插入到重组质粒中 ,经连续 5次亚克隆 ,分别获得 2、4、6、8、10和 12拷贝的多体自切割核酶。在T7RNA聚合酶作用下 ,线性化重组质粒转录的多体自切割核酶通过内部的顺式切割释放出较多数量的核酶分子 ,提示在转录水平能够提高核酶转录物的浓度。用相同摩尔浓度的单体和 12体自切割核酶分别对3 2 P标记的靶ASSVd进行反式切割 ,核酶与靶RNA摩尔浓度比为 1:1。放射自显影结果表明 :多体自切割核酶对靶ASSVd的切割效率明显高于单体自切割核酶。
- 孙洁霖张朝春周丽杨希才
- 关键词：苹果锈果类病毒克隆转录物
- 神经营养素-3基因的人工合成及其在毕赤酵母中的分泌性表达被引量：11
- 2004年
- 根据人神经营养素 3(Humanneurotrohin 3,hNT 3)的基因序列 ,把编码氨基酸的密码子转换成毕赤酵母(Pichiapastoris)偏爱的形式 ,设计了 10条 36～ 5 9nt的寡聚核苷酸引物 ,通过 5次连续PCR反应 ,获得了人工合成的NT 3cDNA片段 (简称NT 3b基因 )。将合成的NT 3b基因克隆到pPIC9K质粒上 ,获得重组表达载体pPIC9K NT 3b。将重组表达载体pPIC9K NT 3b和pPIC9K hNT 3分别电击转化宿主毕赤酵母GS115菌株 ,经筛选得到重组转化子。不同转化子经甲醇诱导 ,表达产物进行SDS PAGE检测、Westernblot检测和ELISA分析 ,结果表明 ,NT 3b基因和hNT 3基因成功获得分泌性表达 ,从整体水平上 ,使用偏爱密码子的NT 3b基因在毕赤酵母GS115菌株中的表达明显优越于hNT 3基因 (x2 =4 .334,P <0 .0 5 ) ,表达量在诱导后 72～ 96h最高 ,达到 31mg L左右。
- 张朝春梁伟锋杨希才
- 关键词：神经营养素-3基因毕赤酵母分泌性表达偏爱密码子
