李琳
- 作品数：16 被引量：64H指数：5
- 供职机构：南京医科大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家高技术研究发展计划南京市医学科技发展项目更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 利用CRISPR/Cas9技术构建ACE2基因修饰的猪胎儿成纤维细胞系
- 2022年
- 目的:利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建血管紧张素转换酶2(angiotensin converting enzyme 2,ACE2)基因编辑的长白猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblast,PFF)细胞系,为构建新型冠状病毒即严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(severe acute respiratory syndrome coronavirus type 2,SARS-CoV-2)不易感猪模型提供实验材料。方法:(1)利用生物信息学方法对大鼠和鸡的ACE2氨基酸序列进行比对,将大鼠ACE2与SARS-CoV-2 S蛋白相互作用的关键氨基酸残基替换为鸡ACE2的氨基酸残基,设计嵌合的ACE2基因并构建ACE2基因敲入供体。(2)设计并合成靶向猪ACE2基因的sgRNA,克隆到p X330载体上构建ACE2基因打靶载体。(3)将ACE2打靶载体和ACE2基因敲入供体以及Neomycin抗性质粒共转染至长白猪PFF细胞,筛选G418抗性单细胞克隆并进行测序鉴定。结果:根据氨基酸序列比对结果,将大鼠ACE2蛋白的第19、31、34、35、42、353、354位氨基酸残基替换为鸡ACE2的氨基酸残基,设计合成了嵌合的ACE2基因。G418抗性单细胞克隆基因型分析结果显示获得了阳性单细胞克隆。结论:利用CRISPR/Cas9技术成功获得了内源ACE2基因敲除、嵌合ACE2敲入的长白公猪PFF细胞系,为构建SARS-CoV-2不易感猪模型奠定了基础。
- 张成霖方斌刘晓蕊李琳王盈杨海元戴一凡
- 关键词：ACE2
- 根除幽门螺杆菌对消化性溃疡患者胃肠道微生态影响的初步研究
- 背景与目的:肠道微生态在各种疾病中的致病机制愈发引起学者的关注。近年来研究发现幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)感染可能影响其他胃肠道微生物菌群的定植,亦发现胃内共生菌参与了消化性溃疡(Pepti...
- 李琳
- 关键词：消化性溃疡幽门螺杆菌乳酸杆菌
- 文献传递
- 人/猪SERPING1同源性比较及猪SERPING1敲除细胞系的建立
- 2022年
- 目的利用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立SERPING1-/-猪胎儿成纤维细胞(PFFs)系,为构建遗传性血管性水肿模型提供细胞实验材料。方法首先比较人/猪SERPING1氨基酸同源性。其次,分析猪SERPING1基因有效的编码区,据此选择第八外显子为敲除靶点,设计并合成靶向猪SERPING1的单导向RNA(sgRNA),连接到含有Cas9核酸内切酶的pX330载体上,构建SERPING1打靶载体pX330sgRNA,将其转染至猪胎儿成纤维细胞中,G418药物筛选阳性单克隆细胞。最后,用T7E1酶切实验检测靶点编辑情况,测序验证单克隆细胞基因型。结果生物信息学分析结果提示人/猪SERPING1蛋白氨基酸同源性较高,氨基酸比对相似性达到65.87%。成功构建打靶SERPING1的载体,并转染到细胞,药物筛选获得SERPING1基因敲除的单克隆细胞,测序确认了突变的基因型。结论人/猪SERPING1蛋白同源性较高,适合用于构建遗传性血管性水肿模型。构建的Cas9/sgRNA表达载体实现了SERPING1基因编辑,获得基因敲除的单细胞克隆,为后续SERPING1-/-猪模型的构建提供了必需的实验材料。
- 王蒙朱晓晗刘晓蕊李琳王盈杨海元戴一凡
- 基于肠内营养耐受性评分的俯卧位通气患者早期肠内营养实施被引量：34
- 2020年
- 目的探讨肠内营养耐受评估表在急性呼吸窘迫综合征(ARDS)行俯卧位通气患者早期肠内营养(EN)中的应用效果。方法将2014年12月至2019年12月收治的ARDS行俯卧位通气患者30例,按入科时间分为对照组(n=12)和观察组(n=18)。对照组按常规护理方法实施早期肠内营养,观察组在常规护理基础上应用肠内营养耐受评估表指导早期肠内营养的实施。比较两组俯卧位通气治疗期间EN耐受情况、72 h内70%目标热量达标率、达70%目标热量时间,机械通气时间、俯卧位通气时间、俯卧位通气前后前白蛋白指标及ICU住院时间等。结果观察组达70%目标热量的时间显著短于对照组(P<0.05),且观察组喂养量及72 h内70%目标热量达标率显著高于对照组(P<0.05,P<0.01)。两组胃肠道并发症发生率及预后指标方面比较,差异无统计学意义(均P>0.05)。结论肠内营养耐受性评估表在指导行俯卧位通气治疗患者早期肠内营养的护理中具有重要的价值,能规范早期肠内营养方案,及早发现并积极防治肠内营养不耐受情况,对提高俯卧位通气患者早期肠内营养支持成功率有重要的意义。
- 李琳李纯陈静
- 关键词：急性呼吸窘迫综合征俯卧位通气肠内营养
- 利用CRISPR/Cas9技术高效构建巴马小型猪F9基因敲除细胞系被引量：1
- 2022年
- 目的:利用CRISP/Cas9基因编辑技术建立巴马小型猪F9基因敲除的胚胎成纤维(porcine fetal fibroblast,PFF)细胞系,为后续构建血友病乙巴马小型猪模型提供原材料。方法:首先通过生物信息学方法对人和猪F9基因同源性进行分析,模拟并分析人和猪FⅨ二级、三级结构的相似性;其次选取猪F9基因的第2外显子为敲除靶点,利用CRISPR在线靶点设计工具(http://www.e-crisp.org/E-CRISP/designcrispr.html)设计并合成单链向导RNA(single guide RNA,sgRNA),以pX330质粒为骨架构建打靶载体,同G418抗性质粒一同转染至野生巴马小型猪的PFF中,经药物G418筛选获得抗性单细胞克隆,测序并鉴定其基因型。结果:生物信息学分析表明人和猪的F9基因具有较近的遗传距离,FⅨ的氨基酸序列相似值为83.33%,三维结构的均方根偏差(root mean square deviation,RMSD)值为0.149。成功构建打靶载体并转染PFF细胞,药筛后共获得55个单细胞克隆,经过测序显示有25个单细胞克隆的F9基因发生突变,计算敲除率为45.5%。结论:人和猪F9基因具有高度同源性;构建的Cas9/sgRNA表达载体可以高效编辑PFF中的F9基因。最终获取F9基因敲除的单细胞克隆,为构建乙型血友病巴马小型猪模型奠定了重要的前期工作基础。
- 朱晓晗刘晓蕊李琳王盈杨海元戴一凡
- 关键词：血友病乙
- 腺苷预适应在体外循环中对心肌及肺的保护作用
- 目的：研究腺苷及腺苷转运抑制剂双嘧达莫药理性预适应在体外循环心脏直视术中对心肌及肺的保护作用。
方法: 56例心脏瓣膜置换术患者随机分为四组：双嘧达莫组(Dip组，n=14)术前口服双嘧达莫(腺苷转运抑制);腺...
- 李琳
- 关键词：腺苷缺血预适应心肌保护肺保护
- 文献传递
- n-3多不饱和脂肪酸对NOD小鼠T细胞的免疫调节作用被引量：6
- 2019年
- 目的:探讨n-3多不饱和脂肪酸(n-3 poly unsaturated fatty acid,n-3 PUFA)对NOD小鼠T细胞免疫学功能的影响。方法:取野生型Balb/c小鼠和已出现典型的Ⅰ型糖尿病症状的NOD小鼠脾脏细胞,磁珠分选后获得小鼠CD4^+T细胞,将其分为4组:野生型小鼠为Wild type组;NOD小鼠分为未处理组、二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)处理组、二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid,EPA)处理组。DHA、EPA处理24 h,PMA和Ionomycin刺激活化后,采用CCK-8法检测T细胞增殖、流式细胞仪检测Th1/Th2极化、ELISA法检测T细胞细胞因子的分泌水平变化。结果:DHA、EPA对T细胞增殖具有显著抑制作用,促进NOD小鼠Th2细胞分化,抑制Th1细胞分化,经ELISA检测,DHA和EPA能够抑制T细胞IL-6、IL-17的分泌。结论:n-3多不饱和脂肪酸通过抑制T细胞增殖,平衡Th1/Th2比例和抑制IL-6、IL-17的分泌,对NOD小鼠的T淋巴细胞起到免疫抑制作用。
- 李琳李晓曦毕欣芸刘珊珊戴一凡
- 关键词：N-3多不饱和脂肪酸T细胞NOD小鼠
- α-半乳糖苷酶A基因敲除猪胎儿成纤维细胞系的建立
- 2022年
- 目的 基于CRISPR/Cas9技术构建α-半乳糖苷酶A (GLA)基因敲除的巴马公猪胎儿成纤维细胞(PFFs),为构建人类Fabry病猪模型提供实验材料。方法 利用生物信息学方法对人/猪GLA基因编码的α-Gal A的相似性进行分析,并鉴定出猪α-Gal A的催化残基位置。通过在线工具在编码催化残基之前的外显子区设计单链向导RNA,构建CRISPR/Cas9打靶载体。将打靶载体与抗性质粒共转染至巴马公猪胎儿PFFs,用G418药物筛选出单克隆细胞,并PCR测序鉴定。结果 人/猪α-Gal A的氨基酸序列一致性为81%,相似性为89%;三维结构的均方根偏差值为0.012。猪α-Gal A的催化残基是第174位和第235位的天冬氨酸。成功构建CRISPR/Cas9打靶载体,并筛选出单克隆细胞,PCR测序鉴定其基因型。结论 用生物信息学方法验证了人/猪α-Gal A具有高度的相似性。利用CRISPR/Cas9技术获得了GLA基因敲除的巴马公猪PFFs细胞系,为构建人类Fabry病猪模型奠定了基础。
- 冷允俊刘晓蕊李琳王盈杨海元戴一凡
- 关键词：FABRY病Α-半乳糖苷酶A
- GGTA1/β4GalNT2双基因敲除近交系五指山小型猪的建立被引量：6
- 2019年
- 目的:利用CRISPR/Cas9技术建立五指山小型猪近交系GGTA1/β4GalNT2双基因敲除克隆猪。方法:设计合成靶向猪GGTA1和β4GalNT2基因的单导向RNA(single guide RNA,sgRNA),以pX330质粒为骨架,分别构建GGTA1和β4GalNT2的Cas9打靶载体,转染至近交系五指山小型猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblast,PFF)中,通过G418药物筛选和测序鉴定获得双基因敲除的单细胞克隆,然后利用体细胞克隆技术(somatic cell nuclear transfer,SCNT)获得双基因敲除的近交系五指山小型猪,并利用流式细胞技术检测克隆猪外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中αGal和Sd(a)抗原的表达。结果:成功构建GGTA1和β4GalNT2基因的Cas9/sgRNA表达载体,转染后获得双基因敲除的近交系五指山小型猪PFF细胞克隆9个。SCNT成功获得了10只五指山小型猪近交系双基因敲除的克隆猪,其PBMC无αGal和Sd(a)抗原的表达。结论:CRISPR/Cas9技术可以实现对猪GGTA1/β4GalNT2基因的编辑。本实验首次成功制备了GGTA1/β4GalNT2双基因敲除的近交系五指山型猪,为异种器官移植研究与应用提供了新的供体材料。
- 李楚任雪洋李琳厉小雪金永张曼玲刘晓蕊熊强张立宁王盈李荣凤杨海元冯书堂戴一凡
- 关键词：异种移植
- 真核细胞表达单纯疱疹病毒Ⅰ型包膜糖蛋白B及其抗原性与免疫原性分析
- 2010年
- 为在真核细胞中表达并纯化I型单纯疱疹病毒(HSV I)包膜糖蛋白gB,并分析其抗原性和免疫原性,化学合成了包膜糖蛋白gB1胞外区基因片段,构建真核表达载体,并转染至HEK293细胞,表达的蛋白用羊抗HSV1+HSV2血清作为一抗,用ELISA检测其抗原性;用纯化的gB1蛋白免疫昆明小鼠,观察诱发抗体产生的时间及其效价,并用ELISA和Western blot检测小鼠抗gB1多克隆抗体特异性识别重组gB1抗原的能力,评价其免疫原性。结果显示在HEK293细胞中成功表达重组gB1蛋白,ELISA证实羊抗HSV1+HSV2多抗能够识别重组gB1蛋白;重组gB1蛋白免疫小鼠7周后,小鼠血清中多克隆抗体效价达到5×103,表明在真核细胞中高效表达并纯化的重组gB1蛋白具有良好的抗原性和免疫原性,为HSV检测试剂和疫苗研究提供了理论基础。
- 王正茂李琳管文燕李越希
- 关键词：单纯疱疹病毒真核表达抗原性免疫原性
