李泮志
- 作品数：4 被引量：8H指数：3
- 供职机构：重庆大学生物工程学院更多>>
- 发文基金：国家科技支撑计划重庆市自然科学基金国家高技术研究发展计划更多>>
- 相关领域：农业科学生物学更多>>
- 柑橘溃疡病菌二硫键稳定Fv抗体基因的构建及表达产物的生物学活性分析被引量：3
- 2009年
- 【目的】构建鼠源抗柑橘溃疡病菌二硫键稳定Fv抗体(dsFv)片段基因,原核表达并将其复性为具有免疫活性的dsFv抗体。【方法】采用PCR定点突变的方法构建dsFv重链(VH)及轻链可变区(VL)基因,分别将其连接入表达载体中,于E.coliBL21(DE3)中诱导表达,表达产物溶解后稀释入复性缓冲液中使其重折叠为dsFv抗体并纯化。SDS-PAGE及Western-blot分析表达及复性产物,BIAcore检测dsFv与Xac-LPS的亲和力,ELISA验证dsFv的特异性及稳定性。【结果】测序结果表明在VH的44位和VL的100位成功引入了半胱氨酸突变位点,实现了高效的原核表达,表达产物主要以包涵体的形式存在。SDS-PAGE分析显示VH和VL的大小为23kD,并将其成功复性,复性后大小为46kD。BIAcore分析表明dsFv对Xac-LPS保持了很高的亲和力,亲和常数(KD)达到3.40×10-10M。ELISA证明dsFv具有较高的抗原特异性并且热稳定性较scFv提高近20℃。【结论】成功表达并复性了dsFv抗体,为柑橘溃疡病菌的免疫诊断提供了高效优质的重组抗体。
- 王中康李泮志袁青于红李蒙殷幼平
- 关键词：柑橘溃疡病菌包涵体复性
- 抗柑桔溃疡病菌可溶性单链抗体的表达及鉴定被引量：3
- 2009年
- 前期采用核糖体展示技术筛选了抗柑桔溃疡病菌(Xanthomonas axonopodis pv. citri,Xac)高亲和力单链抗体(Single chain variable fragment,scFv)GX13、GX44和GX95,为高效表达具有生物活性的单链抗体,本研究将前期筛选的高亲和力单链抗体基因转入大肠杆菌HB2151中进行可溶性表达,点印迹和Western印迹检测可溶性单链抗体的表达水平,亲和层析纯化表达的单链抗体,酶联免疫吸附法(ELISA)检测纯化单链抗体的抗原结合活性.结果显示,3株抗柑桔溃疡病菌可溶性单链抗体在大肠杆菌HB2151中均获得成功表达,表达产物分子量(Mr)约为32.0×103,主要集中于细菌周质腔中.ELISA检测纯化的单链抗体都具备抗原结合活性,可进一步应用于柑桔溃疡病菌的免疫诊断和病害防治.
- 袁青年四季殷幼平李泮志王中康
- 关键词：柑桔溃疡病菌单链抗体可溶性表达
- 柑桔溃疡病菌二硫键稳定Fv抗体基因的构建及产物生物学特性研究
- 柑桔溃疡病(CBCD)是影响全球柑桔种植业发展的重大检疫性病害，其病原菌为地毯草黄单胞柑桔致病变种(Xanthomonasaxonopodis pv.citri)，是国内外重大检疫性有害生物。长期以来由于缺乏抗病品种和特...
- 李泮志
- 关键词：柑橘病害柑桔溃疡病微生物鉴定
- 文献传递
- 优化重叠PCR法进行单链抗体基因扩增和点突变被引量：4
- 2009年
- 利用重叠PCR技术扩增单链抗体基因或位点突变是抗体文库构建或稳定表达的关键和难点，国内外文献未见其方法学的系统报道。以不同VH、VL和Linker基因为拼接模板进行重叠PCR，针对影响重叠PCR扩增的拼接类型，引物设计，反应条件等进行优化。结果表明两段重叠连接比三段更容易实现，且扩增效果好；引物的互补序列长度一般应大于15bp，且在18—24bp时扩增效果最好；退火温度在52—600C，Mg^2＋浓度在1．5—2．5mM时对拼接的效果影响较小；直接或间接使用拼接模板均可以实现重叠PCR的扩增。利用优化策略，首次构建了抗除虫菊酯的scFv基因文库并引入抗XAC糖蛋白scFv基因的点突变，为除虫菊酯抗体文库构建和抗XAC重组抗体的稳定表达奠定了基础。
- 符勇耀李正国李泮志邓伟杨迎伍王中康
- 关键词：重叠PCR单链抗体基因点突变
