李宇立
- 作品数：9 被引量：24H指数：3
- 供职机构：西北农林科技大学动物科技学院更多>>
- 发文基金：陕西省“13115”科技创新工程重大科技专项国家科技支撑计划国家科技重大专项更多>>
- 相关领域：农业科学生物学更多>>
- 猪Jiv90基因打靶载体的构建与细胞转染
- 猪瘟(Classic swine fever,CSF)是一种高度接触性传染病。猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)为有囊膜的单股正链RNA病毒,是黄病毒科(Flaviviridae...
- 李宇立
- 关键词：猪瘟病毒打靶载体RNA干扰
- 文献传递
- 分子伴侣Jiv90基因的克隆及其在猪脐静脉血管内皮细胞中的表达被引量：4
- 2010年
- 为研究分子伴侣Jiv90对猪瘟病毒复制的影响,克隆了分子伴侣Jiv90基因,构建了真核表达载体并在猪脐静脉血管内皮细胞中表达。根据牛的Jiv90基因序列和真核表达载体pEGFP-C1设计引物,经PCR扩增,成功克隆到猪Jiv90基因,回收后与pEGFP-C1载体连接,构建重组表达载体pEGFP-C1-Jiv90,提取质粒并采用脂质体法转染猪脐静脉血管内皮细胞。转染24 h后,荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白表达,经G418抗性筛选得到阳性克隆。本研究成功构建了pEGFP-C1-Jiv90真核表达载体,得到稳定表达Jiv90的细胞株,为今后开展分子伴侣对猪瘟病毒复制影响的研究奠定了基础。
- 刘伟杨幼聪李宇立张彦明
- 关键词：猪瘟病毒真核表达
- 猪血管内皮细胞中分子伴侣Jiv90基因的克隆与原核表达被引量：1
- 2011年
- 克隆到猪Jiv90基因,构建原核表达载体并在大肠埃希菌中表达。从猪血管内皮细胞中克隆到Jiv90基因,将其克隆到pET-32a载体上,构建出重组表达载体,经IPTG诱导表达。结果表明,本试验成功克隆了大小为693 bp的基因,重组质载体pET-32a-Jiv90所表达的蛋白在大肠埃希菌中以包涵体的形式存在,表达产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定大小为46 ku,与预期结果一致。为进一步研究该蛋白的功能及制备抗体奠定了基础。
- 杨幼聪郭抗抗张彦明李宇立张倩程媛媛张三东彭维刚
- 关键词：原核表达
- 布鲁菌病多重PCR快速检测方法的建立及应用被引量：11
- 2010年
- 根据GenBank中登录的布鲁菌(Brucella)omp31、bp26、omp10外膜蛋白基因序列,针对同一种病原,各设计合成了一对特异性引物,通过优化引物浓度组合,建立了检测布鲁菌472 bp、290 bp、162 bp片段的多重PCR快速检测方法。通过对该方法的特异性、敏感性和重复性试验,结果显示,该方法从布鲁菌标准菌株中扩增出了特异性的目的片段,而对大肠埃希菌等细菌的扩增结果均为阴性。经过对10倍倍比稀释的模板进行检测,多重PCR的敏感度为最低可检出1.1×10-3ng的DNA,在感染布鲁菌病奶牛乳汁模拟标本中最低可检出细菌数为80 cfu/mL。不同人员用该方法重复检测,结果均一致,表明重复性好。应用该方法对88份临床疑似布鲁菌感染的奶牛乳样进行了检测,结果检出17份阳性,阳性检出率约为19.3%。检测结果表明,该方法具有特异、敏感、重复性好等优点,可用于奶牛布鲁菌病的临床检测及流行病学监测等。
- 王晶钰张三东刘红彦李河林程媛媛李宇立战美娜
- 关键词：布鲁菌外膜蛋白基因多重PCR
- 猪圆环病毒2型陕西杨凌株的分离鉴定及全基因组分析
- 引言/目的猪圆环病毒2型(PCV-2)是断奶仔猪多系统衰竭综合症(PWMS)的病原,也是引起猪圆环病毒病的主要原因,我国也是受PCV-2危害严重的国家之一。根据基因组序列的差异可将PCV-2分为2个主要的型(群),PCV...
- 汤智慧郭抗抗张彦明王津津李宇立向华
- 文献传递
- 布鲁菌病多重PCR快速检测方法的建立及应用
- 根据GenBank中登录的布鲁菌(Brucella)omp31、bp26、omp10外膜蛋白基因序列,针对同一种病原,各设计合成了一对特异性引物,通过优化引物浓度组合,建立了检测布鲁菌472 bp、290 bp、162 ...
- 王晶钰张三东刘红彦李河林程媛媛李宇立战美娜
- 关键词：布鲁菌外膜蛋白基因多重PCR
- 文献传递
- 猪圆环病毒2型陕西杨凌株的分离鉴定及全基因组分析
- 猪圆环病毒2型(PCV-2)是断奶仔猪多系统衰竭综合症(PWMS)的病原，也是引起猪圆环病毒病的主要原因，我国也是受PCV-2危害严重的国家之一。本研究在对陕西省杨凌及周边地区猪群中PCV-2感染状况进行调查的基础上，初...
- 汤智慧郭抗抗张彦明王津津李宇立向华
- 关键词：猪圆环病毒2型全基因组同源性分析
- 猪圆环病毒2型陕西杨凌株的分离鉴定及全基因组分析被引量：7
- 2011年
- 【目的】分离得到猪圆环病毒2型(PCV-2)陕西杨凌株,测定病毒滴度(TCID50),并进行全基因组序列比对,为研制针对性更强的PCV-2疫苗提供理论依据。【方法】从经PCR检测为猪圆环病毒2型阳性的病料中,分离病毒并接种PK-15细胞,通过PCR检测、间接免疫荧光试验及电镜观察,对分离病毒进行鉴定;用免疫过氧化物酶细胞单层试验(IPMA),测定分离毒株的TCID50,并对其全基因组序列进行测定与分析。【结果】分离得到1株猪圆环病毒2型毒株,分离株在PK-15细胞上的TCID50为10-4.75。全基因组序列同源性比对发现,分离株与一加拿大分离株(DQ200735)同源性最高(99.4%)。【结论】从陕西杨凌分离得到了1个猪圆环病毒2型分离株。
- 汤智慧郭抗抗张彦明王津津李宇立向华
- 关键词：猪圆环病毒2型TCID50
- 猪Jiv90基因打靶载体的构建与细胞转染试验被引量：2
- 2011年
- 【目的】构建猪Jiv90基因的同源打靶载体,并转染猪血管内皮细胞系(SUVEC),对Jiv90基因的敲除效果进行初步验证。【方法】根据NCBI中公布的Jiv90基因序列,克隆得到Jiv90基因核心区两侧的基因序列,并以此为长短臂,构建了可定点敲除Jiv90基因的打靶载体。用该载体转染SUVEC,通过新霉素(G418)和丙氧鸟苷(GANC)的筛选得到稳定的细胞株,再利用PCR检测neo基因在细胞基因组上的整合情况,最后对筛选得到的neo阳性细胞进行猪瘟病毒(CSFV)感染试验,并用实时定量PCR(Real-time PCR)检测CSFV的增殖情况。【结果】以提取所得品质良好的SUVEC全基因组DNA为模板,克隆得到了针对Jiv90基因打靶的核心区两侧基因序列,基因片段长度分别为4 522bp和1 944bp。将长短臂与打靶骨架载体pA2T相连后,构建了关于猪Jiv90基因的同源打靶载体JKS。用JKS载体转染SUVEC,通过1 500μg/mL G418和200nmol/mL GANC正负筛选,得到了稳定转染JKS载体的SUVEC。对于稳定筛选后的试验组细胞,感染CSFV并进行Real-time PCR,结果表明,正常细胞中的CSFV核酸含量是转染JKS载体细胞的3.65倍。【结论】成功扩增了针对猪Jiv90基因的同源长短臂,并构建了猪Jiv90基因的打靶载体JKS,敲除Jiv90基因细胞中的CSFV核酸片段含量显著降低,说明Jiv90基因的敲除可降低细胞中猪瘟病毒的增殖量。
- 李宇立张彦明程敏杨幼聪
- 关键词：猪血管内皮细胞打靶载体细胞转染猪瘟病毒
