康恺
- 作品数：8 被引量：24H指数：3
- 供职机构：西北农林科技大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金公益性行业(农业)科研专项家畜疫病病原生物学国家重点实验室开放基金更多>>
- 相关领域：农业科学生物学更多>>
- 新生山羊肾小管上皮细胞的原代培养与鉴定被引量：3
- 2011年
- 【目的】建立新生山羊肾小管上皮细胞(Renal tubular epithelial cell,RTECs)的分离培养方法。【方法】采集刚出生未哺乳健康山羊的肾脏,分别采用胶原酶Ⅰ和胶原酶Ⅳ消化法分离培养RTECs,选择孔径0.15mm的筛网对RTECs进行纯化,观察各组RTECs的生长情况;对分离的RTECs进行免疫组化和碱性磷酸酶染色鉴定,并进行透射电镜观察;用流式细胞仪检测RTECs的增殖周期和凋亡情况。【结果】胶原酶Ⅳ对RTECs的消化效果优于胶原酶Ⅰ,所得的细胞团块多,纯度高,细胞生长快,经孔径0.15mm的筛网过滤后,RTECs的纯度达95%以上,并可连续传至第12代。分离获得的细胞经免疫组化法和碱性磷酸酶染色法鉴定呈阳性;透射电镜观察显示,细胞表面有微绒毛和桥粒连接。用流式细胞仪检测的结果显示,第4代新生山羊RTECs中G1期和S期细胞分别占细胞总数的25.01%和74.99%,G2/G1为1.97%,第10代细胞中G1期细胞和S期细胞均占50.00%,G2/G1为1.88%;第4代细胞的早期凋亡率在0.32%左右,而第10代可达3.7%,远高于第4代细胞。【结论】建立了增殖快、细胞活力高的山羊RTECs分离培养方法。
- 向华张彦明程媛媛康恺杨幼聪
- 关键词：原代培养酶消化纯化
- 牛奶中布鲁氏菌和单增李斯特菌双重PCR检测方法的建立被引量：5
- 2011年
- 【目的】建立牛奶中布鲁氏菌和单增李斯特菌的双重PCR检测方法。【方法】根据布鲁氏菌IS711序列和单增李斯特菌毒力因子HlyA序列设计并合成引物,建立双重PCR检测方法,对其特异性、敏感性和重复性进行检测,并制备污染模型乳,通过直接检测、增菌后检测、细菌富集后增菌检测,确定最低检测限。【结果】建立了牛奶中布鲁氏菌和单增李斯特菌双重PCR检测方法,该方法特异性好、敏感性高、可重复性好。布鲁氏菌和单增李斯特菌单PCR检测最小DNA质量浓度分别为0.282和3.33 pg/μL,双重PCR检测最小DNA质量浓度分别为2.82和33.3 pg/μL。感染模型乳不经过增菌,布鲁氏菌和单增李斯特菌最低检测限分别为104和8×104CFU/mL;经过24h增菌,就可以检测到10 CFU/mL的布鲁氏菌,经过12 h增菌,就可以检测到8 CFU/mL的单增李斯特菌;经过离心法富集细菌后再增菌,灵敏度可以扩大40~50倍,布鲁氏菌经24 h增菌后最低检测限为10 CFU/40 mL,单增李斯特菌经12 h增菌后最低检测限为8 CFU/40 mL。【结论】建立的双重PCR检测方法特异、灵敏、可重复,可单独或同时检测牛奶中的布鲁氏菌和单增李斯特菌,也可以用于其他产品中布鲁氏菌和单增李斯特菌的检测。
- 程媛媛张彦明向华康恺李艳明徐磊董玲娟张三东
- 关键词：布鲁氏菌单增李斯特菌双重PCR牛奶
- 猪血管内皮细胞中与猪瘟病毒相关microRNA的初步筛选被引量：4
- 2010年
- 本试验旨在筛选猪脐静脉血管内皮细胞(SUVECs)内作用于猪瘟病毒(CSFV)的microRNA。通过构建CSFV3′和5′非翻译区(Untranslated region,UTR)的双荧光素酶报告基因载体,经生物信息学预测可能与CSFV相互作用的microRNA,然后瞬时共转染重组载体与microRNA的抑制物,最后通过发光检测仪测定荧光素酶活性。结果表明,成功构建了CSFV5′非翻译区(373 bp)和3′非翻译区(252 bp)的报告基因载体,并合成了4条预测出的microRNA(ssc-mi R-let7c、ssc-mi R-106a、ssc-mi R-18、ssc-mi R-139)的抑制物,共转染后发光检测仪检测到荧光素酶的活性被不同程度抑制。本研究发现microRNA作用位点主要在CSFV的3′-UTR,而且以上4种microRNA都对CSFV3′-UTR有不同程度的抑制作用,其中ssc-mi R-18的抑制作用比较明显。
- 侯勃张彦明朱晓娟康恺代晨唐青海
- 关键词：猪瘟病毒MICRORNA
- 猪瘟病毒NS2 3′端基因的克隆与原核表达被引量：2
- 2011年
- 从真核表达载体pEGFP-NS2中克隆得到猪瘟病毒(CSFV)NS2 3′端的基因片段,将其克隆到pET-32a载体上,构建出重组表达载体,经IPTG诱导表达。结果表明,克隆了大小为363 bp NS2 3′端的基因,重组载体pET-NS2-C363在大肠埃希菌中以包涵体形式表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定大小为33.84 ku,与预期结果一致。结果为进一步研究NS2蛋白与猪脐静脉血管内皮细胞中蛋白之间的相互作用提供材料及为制备单克隆抗体奠定基础。
- 杨幼聪张彦明康恺向华汤智慧张三东
- 关键词：猪瘟病毒NS2基因原核表达
- 猪瘟病毒石门株调控猪巨噬细胞Toll样受体介导的天然免疫应答
- 引言Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)通过介导天然免疫应答,产生免疫效应分子,对侵入机体的病毒进行清除,而病毒为了能够生存也会通过多种方式影响TLRs介导的免疫应答。猪瘟病毒(CSFV)感...
- 曹志张彦明郭抗抗郑敏萍宁蓬勃康恺林鸷张成成
- 酵母双杂交筛选猪血管内皮细胞中与猪瘟病毒NS2蛋白相互作用的蛋白
- 猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的猪瘟(Classical swine fever, CSF)被世界动物卫生组织(OIE)列为必须上报的动物传染病之一。由于CSFV体外培养...
- 康恺
- 关键词：猪瘟病毒酵母双杂交猪血管内皮细胞
- 文献传递
- 猪瘟病毒复制与细胞自噬关系的研究
- 猪瘟(Classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)感染引起的猪的病毒性传染病,其典型症状与病理特征为高热、全身组织弥散性出血。猪瘟有...
- 康恺
- 关键词：猪瘟病毒病毒复制自噬细胞周期ST细胞
- 文献传递
- 猪瘟病毒促进细胞自噬并利于病毒增殖被引量：7
- 2014年
- 细胞自噬在病毒的增殖、释放中有着重要的作用,目前国内仍然没有猪瘟病毒与细胞自噬相互作用关系的报道。本研究旨在探讨猪瘟病毒Shimen株感染宿主细胞(ST)后对细胞自噬的影响,以及细胞自噬对病毒增殖的作用。通过透射电镜和自噬体标记分子LC3的荧光聚点的观察,直观判断病毒对自噬的影响;并通过Western blot,检测LC3蛋白和P62蛋白的表达量,以及LC3蛋白转化分析,确定猪瘟病毒感染促进细胞自噬发生。利用自噬促进剂雷帕霉素、抑制剂3-MA、自噬体与溶酶体融合阻断剂氯喹(CQ),以及自噬基因Beclin 1、LC3蛋白的干扰,调控自噬来研究自噬对病毒增殖的影响。结果表明,病毒感染细胞促进了细胞自噬的发生,且能形成完整的自噬过程,同时病毒利用细胞自噬来促进自身增殖。本研究为探索猪瘟病毒与宿主细胞相互作用关系增加了新的数据。
- 康恺林鸷高海慧张成成李河林梁武龙王静曹志张彦明
- 关键词：猪瘟病毒细胞自噬病毒增殖自噬相关基因
