邹小辉
- 作品数：32 被引量：25H指数：3
- 供职机构：中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家科技重大专项国家科技支撑计划更多>>
- 相关领域：医药卫生农业科学自动化与计算机技术生物学更多>>
- 一种禽4型腺病毒载体、构建方法及其减毒活疫苗和应用
- 本发明公开了一种禽4型腺病毒载体、构建方法及其减毒活疫苗和应用。本发明的禽4型腺病毒载体包括pBR322质粒的复制起点核酸序列、卡那霉素抗性基因核酸序列和禽4型腺病毒的基因组序列；所述禽4型腺病毒的基因组序列中，ORF1...
- 邹小辉鲁茁壮刘兴龙章振华赵蕾
- 利用293细胞拯救和扩增重组人41型腺病毒
- 2015年
- 人41型腺病毒(Human adenovirus type 41,HAdV-41)为难养腺病毒,E1区缺失的HAdV-41无法在293细胞中拯救并扩增,本研究试图通过反向遗传学操作获得能够在293细胞中拯救并扩增的重组HAdV-41。首先,对原有的骨架质粒pAdbone41进行改造:通过重叠延伸PCR方法将HAdV-41的E3区基因替换为HAdV-5E4orf6编码区;将HAdV-5E1A增强子克隆至HAdV-41E4区启动子上游,获得新的骨架质粒pAdbone41E4EE。该骨架质粒与线性化的穿梭质粒pSh41-GFP在E.coli BJ5183菌株同源重组得到腺病毒质粒pAd41E4EE-GFP。pAd41E4EE-GFP经Pme I酶切线性化后转染293细胞,拯救出重组病毒HAdV-41-E4EE-GFP。经过7轮扩增,超速离心纯化后获得1.0ml浓度为8.0×10^(10) vp/mL的重组腺病毒,其感染滴度为1.7×10~9 IU/mL,电子显微镜下观察可见形态完整的病毒颗粒,限制性内切酶酶切分析及PCR鉴定结果均表明携带HAdV-5E4orf6基因与E1A增强子基因的重组腺病毒载体构建正确。本研究利用反向遗传学技术对病毒载体进行改造,实现了在293细胞中培养E1区缺失的HAdV-41的目的。
- 邹小辉郭小娟肖蓉王敏鲁茁壮洪涛
- 关键词：病毒载体
- 光镜-电镜偶联的蛋白标记技术的初步建立
- 邹小辉屈建国鲁茁壮洪涛
- Ⅲa基因缺失的人7型腺病毒载体系统的建立
- 2024年
- 为了获得既能高效扩增外源基因,又不产生复制型子代病毒的腺病毒载体,我们构建了一个Ⅲa基因缺失的单周期腺病毒载体。本研究在前期已构建的E3区携带绿色荧光蛋白GFP的人7型腺病毒载体pK-Ad7E3GFP基础上进行。首先设计引物扩增包含氨苄青霉素抗性基因和质粒复制起点的AMP-ORI片段,利用限制性内切酶Asc I将pK-Ad7E3GFP切割为29.1kb与7.7kb的大小片段,其中,7.7kb小片段与AMP-ORI片段组装,获得第一个中间质粒pA-Ad7E3GAscI;经重叠延伸PCR、酶切、DNA组装等方法,将pA-Ad7E3GAscI上的Ⅲa基因进行删除,获得第二个中间质粒pA-AscDⅢa;经Pme I酶切的pA-AscDⅢa与上述29.1kb大片段经DNA组装后,得到重组腺病毒质粒pK-Ad7DⅢaE3GFP。同时,构建携带Ⅲa基因的真核表达载体pTPL-Ⅲa,转染293细胞,经G418筛选构建细胞系293-Ⅲa。结果发现,经Pme I线性化的pK-Ad7DⅢaE3GFP质粒转染293-Ⅲa细胞,7d后可见荧光聚集,且逐渐增大,表明重组腺病毒Ad7DⅢaE3GFP拯救成功;提取病毒基因组进行PCR鉴定,结果与预期相符;细胞培养上清经负染后,在电镜下可见腺病毒典型的正二十面体形态,培养细胞中也可见病毒呈晶格排列;以上结果均表明Ad7DⅢaE3GFP拯救成功。本研究成功建立了Ⅲa基因缺失的单周期人7型腺病毒载体系统,为该载体的研究与应用奠定基础。
- 王洋王永进侯文哲郭小娟郑贵森邹小辉
- 关键词：病毒拯救
- 人巨细胞病毒感染指示细胞株的建立
- 2015年
- 目的 建立指示细胞株,该细胞株被人巨细胞病毒（HCMV）感染后能够诱导表达绿色荧光蛋白（GFP）.方法 使用PCR方法克隆GFP基因和HCMV UL54基因的启动子（UL54p）;用GFP替换质粒pGL4.17[luc2/Neo]中的luc2基因,并将UL54p序列插入多克隆位点得到报告质粒pGL4UL54p-GFP.将该质粒转染永生化的人胚肺成纤维细胞MRC-5T,通过G418筛选,获得多株克隆化的MRC-5TUG细胞.使用HCMV（AD169毒株）感染各株MRC-5TUG,利用荧光显微镜观察GFP表达情况.使用人5型腺病毒和H1N1甲型流感病毒感染筛得的目的细胞株,观察GFP表达情况.结果 构建的报告质粒pGL4UL54p-GFP经酶切和测序鉴定,证实与预计的一致.质粒转染MRC-5T细胞,筛得9株MRC-5TUG克隆化细胞株;HCMV感染后,有2株细胞GFP表达由阴转阳,其中MRC-5TUG#7细胞GFP表达最强.人腺病毒和流感 病毒感染MRC-5TUG#7,GFP不表达.结论 成功构建了MRC-5TUG细胞,该细胞可以用于指示HCMV的感染。
- 郭小娟邹小辉吴萌屈建国鲁茁壮洪涛
- 关键词：巨细胞病毒基因表达荧光抗体技术
- 适配器-超速离心法提高电镜检测病毒的灵敏度被引量：1
- 2010年
- 通过专用超速离心机将病毒直接离心至载网是重要的提高诊断电镜灵敏度的方法,作者尝试建立适配器-超速离心法实现相同目的。设计制造了外形类似离心管的载网适配器,其内部有一平底的凹槽,可以放置电镜载网,添加病毒悬液后,经过超速离心,能够将病毒粒子直接离心到载网上。利用重组腺病毒和重组腺相关病毒为模式病毒,适配器-超速离心法较悬滴法的病毒检测灵敏度提高了50～200倍;对人腺病毒41型(Ad41)细胞培养物进行电镜检测,灵敏度提高了50倍。如果将免疫凝集法(immune clumping)与适配器-超速离心法相联合进行电镜制样,检测灵敏度较常规免疫凝集法提高1～2个数量级。这些结果说明适配器-超速离心法能够高效地富集病毒,可以应用于病毒的电镜检测工作。
- 屈建国余兴明鲁茁壮邹小辉宋敬东洪涛
- 关键词：适配器超速离心
- 靶向感染哺乳动物细胞的禽4型腺病毒载体及其应用
- 本发明公开了靶向感染哺乳动物细胞的禽4型腺病毒载体及其应用，载体包括禽4型腺病毒的基因组序列、pBR322的复制起点核酸序列和卡那霉素抗性核酸序列；所述基因组序列中的fiber核酸序列经过人工改造，包括：在fiber基因...
- 鲁茁壮郭小娟颜丙玉邹小辉
- 文献传递
- 人腺病毒41型纤维丝状包涵体免疫电镜研究被引量：1
- 2013年
- 为明确人腺病毒41型(Adenovirus type 41,Ad41)形态发生过程中形成的纤维丝状包涵体(Fibrillous inclusion body,FIB)是否含有Ad41的长纤维(Long fiber,LF)蛋白与短纤维(Short fiber,SF)蛋白。我们分别原核表达和纯化Ad41LF、SF的球部(Knob)蛋白,分别命名为LFK与SFK。以LFK和SFK分别免疫BALB/c小鼠,分别获得LFK抗血清和SFK抗血清。Western blot、间接免疫荧光和免疫负染结果表明,LFK抗血清和SFK抗血清分别与LF和SF结合,LFK抗血清和SFK抗血清之间无交叉反应,可以应用于免疫电镜标记。通过Ad41抗血清、腺病毒纤维单克隆抗体4D2、LFK抗血清与SFK抗血清分别对FIB进行免疫电镜胶体金标记,表明Ad41抗血清、腺病毒纤维单克隆抗体4D2、LFK抗血清与SFK抗血清均能标记FIB,说明FIB中含有Ad41长纤维蛋白和短纤维蛋白。
- 宋敬东邹小辉王敏屈建国鲁茁壮洪涛
- 关键词：免疫电镜技术
- 鼻病毒非结构蛋白2B引起细胞自噬产生的研究被引量：1
- 2019年
- 目的利用miniSOG标签观察鼻病毒非结构蛋白2B蛋白在细胞中定位及自噬体产生。方法将非结构蛋白2B和miniSOG进行融合表达构建pcDNA3.1-2B-miniSOG-flag质粒,将质粒转染HEK293细胞,在荧光显微镜下,2B-miniSOG阳性细胞进行固定、光氧化及超薄切片制备,电镜下观察2B-miniSOG蛋白在细胞中的定位及细胞超微结构变化,Westernblot(WB)检测LC3的表达。结果2B-miniSOG蛋白在荧光显微镜下发出绿色荧光,WB检出自噬标志性蛋白LC3-II表达增加。电镜下观察到蛋白定位于线粒体,细胞中出现大量囊泡样结构,可观察到自噬体和自噬溶酶体。结论鼻病毒非结构蛋白2B可引起细胞自噬发生。
- 宋娟邹小辉罗小暖宋芹芹史冰田夏冬刘宓夏志强鲁茁壮韩俊
- 关键词：自噬
- 5型和41型人腺病毒E1B55K与E4orf6蛋白相互作用研究
- 腺病毒(Adenovirus, Ad)载体广泛应用于基因治疗和重组疫苗研究,归其原因有以下几点：外源基因克隆操作简易；病毒生产纯化方便；目的基因转移效率高；安全性好(病毒基因组不整合到宿主染色体)。目前使用的腺病毒载体主...
- 邹小辉
