刘倩
- 作品数：2 被引量：2H指数：1
- 供职机构：上海交通大学生命科学技术学院微生物代谢国家重点实验室更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家重点基础研究发展计划更多>>
- 相关领域：生物学化学工程更多>>
- 利用SpyTag/SpyCatcher构建胞内自组装多酶复合体实现高效生物合成
- 2018年
- SpyTagr和SpyCatche可通过自发反应形成共价键,产生稳定的分子自组装体。酶分子自组装体因具有高效有序的催化特性在合成生物学和纳米技术领域具有重要的应用价值。为探索SpyTag/SpyCatcher在大肠杆菌胞内多酶复合体系形成有序自组装分子能力,将SpyTagr和SpyCatche分别与P450BM3m单加氧酶和葡萄糖脱氢酶GDH进行融合表达,以期产生具有辅酶再生循环系统、高效生物合成靛蓝分子的SpyTag/SpyCatcher双酶自组装复合体。首先,通过电泳及质谱对重组工程菌表达蛋白进行分析,证实SpyCatcher-P450BM3m与SpyTag-GDH在胞内成功形成了自组装多酶复合体;然后,系统分析不同培养条件下组装体合成靛蓝的能力。结果发现,经0.5mmol/L IPTG诱导后,菌体在16℃继续培养18h后,工程菌对吲哚（2mmol/L）与葡萄糖（4mmol/L）的全细胞催化能力最强,靛蓝产量最高达258mg/L,是未组装多酶系统的1.9倍,比P450BM3m单酶表达系统高约2.4倍;反应70min后达到反应平衡,转化率为52%。成功实现了SpyTag/SpyCatcher介导的多酶体系在大肠杆菌细胞中的自组装和高效转化体系,为胞内多酶复合物组装体的设计提供了新思路。
- 刘璐殷亮黄飞张勇刘倩冯雁
- 关键词：自组装辅酶再生靛蓝
- 杀粉蝶菌素A1生物合成基因簇中甲基转移酶PieB2的功能被引量：2
- 2016年
- 【目的】研究杀粉蝶菌素A1产生菌中甲基转移酶基因pieB2的功能。【方法】利用接合转移和同源重组双交换的方法,构建pieB2基因缺失突变株,以及利用接合转移的方法,构建回补菌株。通过高保真PCR克隆pieB2基因到表达载体pET28a上,构建质粒pJTU5997,转化入大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pLysE中诱导表达。利用高效液相色谱检测PieB2的体外酶活。【结果】获得了pieB2基因缺失的双交换突变株。发酵结果显示,该突变株不再产生杀粉蝶菌素A1,而是积累了一种脱甲基产物。N-末端融合组氨酸标签的PieB2在大肠杆菌中获得可溶性表达,通过体外催化证明了PieB2甲基转移酶的功能。【结论】体内遗传实验和体外生化实验证明了PieB2作为甲基转移酶在杀粉蝶菌素A1合成中的作用。
- 赵震宇刘倩由德林
- 关键词：甲基转移酶基因敲除生物合成
