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粒细胞集落刺激因子(G-CSF)在大肠杆菌中的高效表达及快速纯化工艺的建立被引量：4: 1998年; 基因工程重组人粒细胞集落刺激因子（ｒｈＧ－ＣＳＦ）主要用于癌症患者化疗后的粒细胞减少症．在正确克隆人Ｇ－ＣＳＦｃＤＮＡ的基础上，重点对Ｇ－ＣＳＦｃＤＮＡ的５′端进行了较为彻底的修饰，修饰后的基因插入ｐＢＶ２２０载体组建成功ｐＢＶ２２０／Ｇ－ＣＳＦ／２－１７４高效表达载体．表达后ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析其表达最高达５０％以上．根据Ｇ－ＣＳＦ表达形成包涵体这一特性，建立了一条简便、稳定，适用于大规模生产的分离纯化工艺流程．首先分离纯化包涵体，８ｍｏｌ／Ｌ尿素裂解包涵体，稀释复性蛋白，之后一步ＳＰ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ柱层析至均质．纯化的Ｇ－ＣＳＦ比活性达３．４×１０８Ｕ／ｍｇ蛋白，每升表达菌液回收的Ｇ－ＣＳＦ总活性达１．０６×１０１１Ｕ．纯化产物的Ｎ－端氨基酸序列分析表明，对甲硫氨酸的去除彻底。; 李福胜贡惠宇赵炳文余彩玲侯斌陈爱君张智清侯云德; 关键词：G-CSF 原核表达纯化 PBV220 基因修饰

人血管内皮细胞生长因子在大肠杆菌中的表达及纯化: 2000年; 目的　为了获得大量重组人血管内皮细胞生长因子（ＨｕｍａｎＶａｓｃｕｌａｒＥｎｄｏｔｈｅｌｉａｌＧｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ，ｈＶＥＧＦ），以研究其在心血管和药学领域具有的潜在药用价值。方法　用ＰＣＲ方法扩增目的基因ｈＶＥＧＦ１６５，连接到ｐＥＴ－３ａ载体上，并转化到大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中，建立可高效表达的ｐＥＴ－３ａ／ｈＥＶＧＦ１６５重组质粒，经ＩＰＴＧ诱导表达，Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ检测表达产物的抗原性，通过ＭｏｎｏＱ阴离子层析和ＦＰＬＧ　Ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２分子筛柱层析，进行初步纯化，用ＭＴＴ法检测其生物学活性。结果　ｐＥＴ－３ａ／ｈＥＶＧＦ表达产物经纯化后，其纯度可达到９０％以上，表达的ｒｈＥＶＧＦ１６５能呈剂量依赖性地促进人静脉内皮细胞（ＨＵＶＥＣ）的增殖。结论组建了天然形式ｈＥＶＧＦ１６５的大肠杆菌菌株，并摸索出一套纯化工艺，为大规模生产重组ｈＥＶＧＦ１６５奠定了基础。; 周小明曾革非钭理强安乃莉姚立红陈爱君张智清; 关键词：血管内皮细胞因子纯化大肠杆菌

应用硫氧还蛋白促进外源蛋白在大肠杆菌的可溶性表达被引量：21: 1999年; 为了观察硫氧还蛋白（ＴｒｘＡ）促进外源蛋白在大肠杆菌中可溶性表达的作用，我们从质粒ｐＥＴ－３２ａ（＋）上克隆了ｔｒｘＡ基因，构建了ＴｒｘＡ表达质粒ｐＴ－ＴｒｘＡ。将该质粒与其它蛋白基因的表达质粒共同转化Ｅｃｏｌｉ并同时获得表达。结果表明，共表达ＴｒｘＡ可以明显促进外源蛋白，如甲状旁腺激素相关蛋白（ＰＴＨｒＰ）、ＰＴＨｒＰ受体（ＰＴＨｒＰ－Ｒ）和血管内皮生长因子（ＶＥＧＦ）的可溶性表达。说明共表达ＴｒｘＡ有助于外源蛋白的正确折叠，防止包涵体的形成。; 安乃莉张智清王嵩刘红兵曾革非姚立红陈爱君; 关键词：硫氧还蛋白共表达外源蛋白大肠杆菌

TNF受体(P55)和IgGFc的融合蛋白在哺乳动物细胞中的表达被引量：1: 2001年; 目的　在真核细胞表达具有生物活性的可溶性肿瘤坏死因子 (TNF)受体蛋白 ,用于中和TNF的毒性。方法　将TNFR(P5 5 )的胞外区基因和人IgGFc段基因通过 18个碱基的凝血酶切点连接 ,克隆入真核表达载体pcDNA3 1(+ ) ,在COS7和BHK细胞分别得到目的蛋白的表达。结果　在真核表达系统表达了TNFR(P5 5 )胞外区与人IgGFc段的融合蛋白 ,免疫学实验及L92 9细胞体外实验均表明该蛋白具有TNFR(P5 5 )特异的抗原性、与TNF结合的活性以及抑制TNF的活性。结论　真核表达的融合蛋白产物具有可溶性TNF受体 (P5 5 )的生物学活性。; 安乃莉徐春晓姚立红陈爱君曾革非张立国张智清; 关键词：肿瘤坏死因子真核表达系统

TNF受体(P55)胞外区基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达被引量：2: 2001年; TNF与多种疾病密切相关。为了获得大量具有生物学活性的可溶性TNF受体用以拮抗TNF的毒性作用 ,在原核表达系统中表达了TNFR(P5 5 )的胞外区与TrxA的融合蛋白。将TNFR(P5 5 )胞外区去信号肽的前三个结构域基因克隆入融合蛋白表达载体 pET 32a ,在大肠杆菌BL2 1(DE3)中高效表达了TrxA TNFR融合蛋白。表达产物以包涵体形式存在 ,经过变性和复性 ,并经镍金属鳌和柱亲和层析纯化 ,得到了纯度较高的可溶性受体蛋白的初纯品。免疫学实验及L92 9细胞体外实验均表明 :该蛋白具有TNFR(P5 5 )特异的抗原性、与TNF结合的活性以及良好的抑制TNF的生物学活性。; 安乃莉徐春晓姚立红陈爱君曾革非张立国张智清; 关键词：基因克隆融合蛋白大肠杆菌

可溶性人肿瘤坏死因子受体Ⅱ(sTNFRⅡ)在大肠杆菌中的表达及其活性检测被引量：3: 2001年; 肿瘤坏死因子 (TNF)是一种多功能性的细胞因子 ,与许多重大疾病有关。为了抑制TNF的生物学活性 ,将TNF受体Ⅱ胞外区在大肠杆菌中进行了可溶性表达 ,并通过金属鳌合层析柱纯化重组蛋白。结果表明 ,纯化的重组蛋白能够识别并结合TNF ,同时能中和TNF的生物学活性 ,抑制其对细胞的杀伤作用 ,具有潜在的临床应用前景。; 徐春晓姚立红陈爱君安乃莉曾革非张立国张智清; 关键词：肿瘤坏死因子受体可溶性受体大肠杆菌

VEGF受体KDR胞外区基因的克隆及其在昆虫细胞中的表达被引量：6: 2001年; VEGF(血管内皮细胞生长因子 ,VascularEndothelialGrowthFactor)是刺激内皮细胞增殖和新生血管形成的最重要因子 ,与多种实体瘤的生长和转移密切相关。应用其可溶性受体阻断它的病理作用是一个非常有前景的课题。将VEGF受体KDR胞外区前三个Loop 96 9碱基对的cDNA片段克隆到杆状病毒表达载体pFastBacI,与杆状病毒表达载体Bacmid同源重组后 ,转染昆虫细胞SF 9,获得重组杆状病毒并证明了目的基因的高效表达。经Westernblot证实表达产物的特异性。经ELISA和体外生物学活性检测表明表达产物可阻断VEGF的生物学活性 ,抑制鸡胚CAM血管的生长。; 曾革非张智清张立国陈爱君姚立红侯云德; 关键词：血管内皮细胞生长因子受体克隆杆状病毒表达昆虫细胞

血管内皮细胞生长因子受体Flt-1胞外区基因的克隆及其在中国仓鼠卵巢细胞中的表达被引量：1: 2000年; 从原代培养的人脐静脉血管内皮细胞 (HUVEC)提取细胞总RNA ,采用逆转录PCR (RT PCR)方法得到VEGF受体Flt 1胞外区前 3个IgG样区域cDNA片段 (Flt 1n3 )。将获得的受体基因克隆到真核表达载体 pcD NA3.1中 ,得到重组质粒 pcDNA3.1/Flt 1n3 ,通过脂质体转染方法将其转入中国仓鼠卵巢细胞 (CHO) ,用G418筛选得到稳定表达目的蛋白的细胞克隆。经固相结合实验筛选得到表达与VEGF特异结合的目的蛋白的细胞克隆 ,细胞测活结果表明 ,表达产物具有抑制人脐静脉内皮细胞 (HUVEC)增殖的活性。鸡胚测活结果表明 ,CHO细胞表达的rFlt 1n3 能抑制鸡胚绒毛尿囊膜的血管形成。; 曾革非张智清周小明张立国车团结安乃莉陈爱君姚立红; 关键词：VEGF FLT-1 胞外区

人血管内皮生长因子在毕赤酵母菌中的表达和鉴定被引量：4: 2000年; 目的　研究人血管内皮生长因子 (hVEGF16 5 )基因在Pichia .pastoris酵母中的表达 ,获得高效表达的具有生物学活性的重组VEGF16 5。方法　采用聚合酶链反应 (PCR)扩增hVEGF16 5基因 ,经DNA序列分析后 ,插入含AOX1启动子和α分泌信号肽序列的Pichia .pastoris酵母载体中 ,构建重组表达质粒 pPIC9K hVEGF16 5 ,转化酵母宿主菌KM 71,筛选多拷贝整合转化子 ,摇瓶培养 ,1%甲醇诱导表达。结果　SDS PAGE分析显示 ,诱导 4d的培养上清中hVEGF16 5表达量达上清总蛋白的 30 %以上。ELISA及Westernblot实验表明 ,表达产物具有良好的抗原性和特异性。生物学活性检测证实其具有刺激HUVEC增殖的功能。结论　在Pichia .pastoris表达系统中实现了hVEGF16; 马骊张智清陈爱君姚立红姜忠良王小宁; 关键词：内皮生长因子毕赤酵母基因表达

利用酵母双杂交系统研究人血管内皮生长因子受体Flt-1的配体结合域被引量：2: 2000年; The vascular endothelial growth factor (VEGF) receptor Flt-1 is charaterized by seven Ig-like loops within the extracellular domain. To identify which part is responsible for ligand binding, four cDNA clones coding for truncated Flt-1 mutants consisting of loop 1, 1-2, 2-3 and 1-3 were obtained by PCR from human cardiac cDNA library and inserted into the vectors of the yeast two-hybrid system, with VEGF cDNA on the partner plasmid. The paired plasmids were transformed into yeast strain SFY526, and tested by filter membrane method and β-galactosidase activity. The results showed that Flt-1(1-2)、Flt-1(2-3) and Flt-1(1-3) all were able to bind VEGF, of which Flt-1(1-3) showed the highest binding affinity, but no binding of VEGF was observed with Flt-1(2) and VEGF.; 马骊张智清曾革非周小明陈爱君姚立红王小宁; 关键词：酵母双杂交血管内皮生长因子 FLT-1 配体结合域

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陈爱君

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