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SARS冠状病毒E蛋白DNA疫苗的构建及其实验免疫研究: 2006年; 目的构建SARS冠状病毒(SARS-CoV)小囊膜蛋白(E蛋白)的DNA疫苗pVAC-E,观察其在小鼠中诱导的免疫应答。方法采用PCR方法体外扩增SARS冠状病毒E蛋白的基因片段,克隆入真核表达载体pVAC,构建pVAC-E重组质粒。通过脂质体介导瞬时转染非洲绿猴肾(Vero)细胞,Western-blot鉴定E蛋白在细胞中的表达。以基因枪方式免疫小鼠,ELISA检测小鼠血清特异性抗体,MTT法测定淋巴细胞转化率,流式细胞仪检测小鼠脾脏T淋巴细胞亚群分布。结果成功构建SARS-CoVDNA疫苗pVAC-E。Western-blot结果示,转染后的Vero细胞可表达一约9kD大小能被SARS病人血清特异识别的蛋白条带。免疫小鼠中未检测到明显的抗体滴度升高。淋巴细胞转化率在免疫组和对照组间无差别(P>0.05)。脾脏T淋巴细胞亚群分析示免疫组小鼠CD4+细胞显著升高(P<0.05),CD8+细胞与对照组相比无显著差异。结论构建的真核表达质粒pVAC-E能在Vero细胞中表达,表达产物具免疫活性,免疫小鼠后能诱导一定的细胞免疫应答。; 甘燕吴少庭秦莉潘晖榕戴五星袁仕善黄达娜; 关键词：SARS冠状病毒 DNA疫苗

结核分枝杆菌Ag85B基因体外扩增、克隆及在耻垢分枝杆菌中的表达: 2008年; 目的体外扩增结核杆菌Ag85B基因,构建大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭质粒ps3000-Ag85B,并重组耻垢分枝杆菌(Mycobacteriums megmatis mc2155)。方法采用聚合酶链式反应(PCR)方法,体外扩增结核杆菌Ag85B基因,克隆入pGEMT载体;构建亚克隆ps3000-Ag85B大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭质粒,电转化方法将有Ag85B基因的穿梭质粒转化到耻垢分枝杆菌中。热诱导此重组耻垢分枝杆菌,用SDS-PAGE电泳观察Ag85B蛋白的表达,Western blot鉴定其生物学活性。结果PCR扩增结核杆菌Ag85B基因片段大小为990bp,构建的穿梭质粒ps3000-Ag85B酶切片段为990bp,与理论值相符。经Western blot检测,该重组耻垢杆菌表达蛋白能被结核病患者血清识别。结论Ag85B重组耻垢分枝杆菌构建成功,为下一步表达Ag85B蛋白的重组BCG(Bacilli Calmette-Guérin)疫苗的研究奠定了基础。; 李晓恒吴少庭付小强甘燕王芳雷蕾; 关键词：AG85B 重组BCG

重组SARS病毒M蛋白的免疫效应研究被引量：1: 2006年; 目的检测SARS冠状病毒重组M蛋白疫苗诱导小鼠的免疫应答能力。方法PCR扩增M蛋白基因,构建至原核表达质粒pET-23a,pET-23a-M重组质粒转化BL21(DE3)宿主菌,诱导表达蛋白经SDS-PAGE、免疫印迹分析和纯化后免疫BALB/c小鼠,3次免疫后测定免疫功能,进行免疫效果评价。结果成功构建pET-23a-M重组质粒,转化宿主菌后诱导表达27 ku M蛋白。检测M蛋白免疫鼠体内有特异性抗体产生,抗体效价达1∶104;脾脏CD8+比例升高,CD4+/CD8+比值下降;免疫鼠血清IFN-γ和IL-4水平无显著变化。结论SARS病毒重组M蛋白疫苗能诱导BALB/c小鼠产生特异性体液免疫和细胞免疫应答。; 甘燕吴少庭秦莉雷明军戴五星袁仕善黄达娜; 关键词：SARS冠状病毒 M蛋白免疫效应

分泌融合蛋白Ag85B-ESAT-6重组卡介苗在小鼠体内的免疫效应被引量：2: 2009年; 目的研究分泌融合蛋白Ag85B-ESAT-6重组卡介苗(rBCG)在小鼠体内诱导的免疫效应。方法以2×106CFU的rBCG或BCG皮下接种BALB/c小鼠,免疫后第4、6、8周时用ELISA测定TB-PPD特异的血清抗体滴度;分离脾淋巴细胞,以流式细胞术测定CD4+和CD8+T细胞亚群百分比;TB-PPD刺激后以MTT法测定淋巴细胞增殖程度,ELISA检测诱生IFN-γ和IL-10水平。结果rBCG和BCG免疫组小鼠血清特异性抗体滴度分别达1∶5 120和1∶2 560,差异有统计学意义(q=3.89,P=0.034)。rBCG组的IFN-γ水平在第8周达最高(597.1 pg/ml),同期BCG组为416.7 pg/ml,差异有统计学意义(q=10.60,P<0.01)。rBCG组IL-10水平第4周和第6周时也高于BCG组(P<0.05),第8周回落。除第6周外,rBCG组的淋巴细胞增殖指数都高于BCG组(P<0.05)。第8周rBCG组和BCG组CD4+T亚群分别占(71.1±2.6)%和(62.3±2.0)%,差异有统计学意义(q=4.16,P=0.026);CD8+T亚群分别占(35.9±1.7)%和(26.9±2.8)%,差异有统计学意义(q=4.52,P=0.019)。结论融合蛋白Ag85B-ESAT-6引入BCG增强了其抗MTB反应。; 刘洪波蔡昌学吴少庭甘燕; 关键词：融合蛋白 ESAT-6 重组卡介苗

弓形虫GRA4基因体外扩增、克隆及在耻垢分枝杆菌中的表达被引量：11: 2006年; 目的体外扩增弓形虫RH株致密颗粒蛋白4(GRA4)基因,构建大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭质粒ps3000-GRA4,重组耻垢分枝杆菌,鉴定重组蛋白的抗原性。方法用聚合酶链式反应(PCR)方法从弓形虫RH株基因组DNA中扩增GRA4基因,克隆入pGEM-T载体,然后亚克隆法构建ps3000-GRA4大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭质粒,经电转化方法,将GRA4基因片断的穿梭质粒转化到耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatismc2155)中,用重组耻垢分枝杆菌免疫小鼠,Western blot方法检测免疫小鼠血清中的弓形虫抗体。结果成功扩增了弓形虫的GRA4基因并构建克隆质粒pGEMT-GRA4、穿梭质粒ps3000-GRA4,Western blot分析显示,GRA4重组蛋白能被重组质粒免疫小鼠血清识别,分子质量单位约为40.0 ku。结论重组耻垢分枝杆菌在小鼠体内表达出了重组蛋白GRA4,具有抗原性,刺激小鼠机体产生了抗弓形虫的抗体,为弓形虫重组BCG(Bacillus Calmette-Guerin)疫苗的研究奠定了基础。; 李俊华吴少庭翁亚彪甘燕刘洪波刘茂铃张仁利高世同黄达娜耿艺介; 关键词：弓形虫耻垢分枝杆菌 BCG

抗SARS病毒重组BCG-M疫苗的构建及其免疫学研究: 目的寻求有效的抗SARS病毒的重组BCG疫苗并观察其诱导的免疫效应及评价其可能的病理损害。方法以大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒构建表达SARS病毒膜蛋白(M蛋白)的重组BCG疫苗,转化BCG后免疫BALB/c小鼠...; 甘燕李俊华刘洪波刘茂玲张仁利高世同黄达娜耿艺介吴少庭; 关键词：SARS冠状病毒 M蛋白 BCG疫苗; 文献传递

弓形虫SAG2基因在毕赤酵母中的表达及免疫原性研究被引量：6: 2008年; 目的在毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统中表达弓形虫SAG2基因,探索一种新的有效活化机体抗弓形虫免疫反应的疫苗。方法以重组质粒pET23a-SAG2为模板,亚克隆目的片段SAG2至酵母菌分泌表达载体pPICZαA,重组质粒经线性化后电转化转染至毕赤酵母菌GS115菌株,经抗生素Zeocin筛选得到高拷贝转化子。经甲醇诱导表达,取细胞裂解上清进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹法(Western blot)分析。以整体重组酵母菌作为疫苗腹腔免疫BALB/c小鼠,检测小鼠的免疫反应。结果成功构建了pPICZαA-SAG2毕赤酵母表达重组质粒。经甲醇诱导,在酵母细胞内表达分子质量单位为22 ku的蛋白。Western blot显示,22 ku蛋白可被抗-His标签抗体识别。结论在毕赤酵母菌中成功表达了SAG2基因。整体重组酵母活菌具有免疫原性。; 王芳吴少庭黄汉菊李俊华付小强甘燕雷蕾; 关键词：弓形虫毕赤酵母菌基因表达免疫原性

结核分枝杆菌Ag85B的基因克隆及表达被引量：1: 2009年; 目的克隆结核分枝杆菌Ag85B基因,在大肠埃希菌中进行表达,获得纯化的重组Ag85B蛋白。方法以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板,应用PCR方法扩增Ag85B基因,以质粒PET23a(+)为表达载体构建Ag85B重组质粒,转化大肠埃希菌BL21(DE3),以IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE电泳和Western blot技术分析鉴定Ag85B蛋白表达,采用Novagen公司生产的HisBind蛋白纯化试剂盒纯化Ag85B蛋白。结果构建了具有正确基因序列的Ag85B重组表达质粒,经SDS-PAGE分析,诱导表达的重组蛋白分子质量单位约为33ku,Western blot鉴定能被抗His单抗识别,该重组Ag85B蛋白在大肠埃希菌BL21(DE3)中以包涵体形式存在。结论目的基因克隆入宿主菌中并表达成功,纯化的重组Ag85B蛋白为进一步的研究与应用奠定了基础。; 李晓恒吴少庭付小强甘燕王芳雷蕾; 关键词：结核分枝杆菌 AG85B 基因克隆蛋白表达

分泌性表达融合蛋白85B-ESAT-6重组卡介苗的构建和表达被引量：5: 2006年; 目的构建分泌性表达融合蛋白85B-ESAT-6重组卡介苗。方法PCR扩增结核分枝杆菌热休克蛋白60(hsp60)的调控序列和合成T4转录终止序列,分别定向克隆入pBCG2000载体的多克隆位点的上下游,得到E.coli-Mycobacterium穿梭载体质粒pBCG3000。PCR分别扩增出结核分枝杆菌分泌性抗原Ag85B的全编码序列及ESAT-6基因,然后将两基因融合插入pBCG3000载体的hsp60启动子下游得到pBCG3000-85B-ESAT-6分泌性表达质粒。用电穿孔法将pBCG3000-85B-ESAT-6质粒转化BCG细胞,得到重组卡介苗。重组卡介苗经热诱导后,SDS-PAGE电泳和Westernblotting鉴定融合蛋白85B-ESAT-6的表达及其免疫学活性。结果通过PCR、酶切以及测序鉴定,pBCG3000-85B-ESAT-6表达质粒构建完全正确,SDS-PAGE电泳未能直接观察到表达的融合蛋白条带,用ESAT-6蛋白的多抗血清通过Westernblotting证实了该蛋白主要分泌性表达于胞外并具有免疫学活性。结论分泌性表达融合蛋白85B-ESAT-6重组卡介苗构建成功。; 刘洪波吴少庭蔡昌学甘燕秦莉; 关键词：融合蛋白 AG85B ESAT-6 重组卡介苗穿梭质粒

弓形虫GRA4和SAG2基因重组BCG疫苗免疫保护性的比较研究被引量：9: 2007年; 目的比较弓形虫致密颗粒蛋白4(GRA4)基因和表面抗原2(SAG2)基因的重组卡介苗(BCG)对小鼠的免疫保护效果。方法108只SPF级雌性BALB/c小鼠随机分成6组:PBS组、BCG空白菌组、BCG-空白载体组、BCG-SAG2组、BCG-GRA4组和BCG-SAG2+GRA4组,每组18只。每鼠分别注射对应液体/疫苗100μl,共2次,间隔2周。接种前尾静脉采血,接种后4、6、8周每组分别剖杀3只,取脾和眼眶血检测细胞因子、IgG与IgM抗体,T淋巴细胞亚群计数,淋巴细胞转化率等。末次免疫后3周,每组剩余小鼠分别腹腔接种RH株弓形虫速殖子50个进行攻击感染,观察各组小鼠存活时间。结果弓形虫SAG2和GRA4重组BCG疫苗均能诱导小鼠产生免疫应答。第4周时,BCG-GRA4+SAG2免疫组小鼠的CD3+CD4+/CD3+CD8+的比值最高,为14.06%±1.17%。第6周时,BCG-GRA4+SAG2免疫组小鼠的IgG抗体水平最高,为0.18±0.02。第8周时,BCG-SAG2免疫组小鼠的IgM抗体水平最高,为0.82±0.05;弓形虫速殖子攻击后,BCG-SAG2组平均存活8.61d,PBS对照组平均存活7.33d,3个免疫组小鼠比其他3组的平均存活时间长1d。结论弓形虫重组BCG疫苗具有一定的免疫保护性。; 李俊华吴少庭翁亚彪甘燕刘洪波刘茂玲张仁利高世同黄达娜耿艺介; 关键词：弓形虫重组疫苗

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甘燕

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