王秦
- 作品数：18 被引量：50H指数：4
- 供职机构：重庆医科大学检验医学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金广东省科技计划工业攻关项目更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- IL-12通过下调Stat-3诱导巨噬细胞分化为M1型并且抑制肝癌细胞生长
- 目的：研究重组腺病毒pAd5F35-IL-12成功感染人外周血单核细胞后，高表达IL-12的单核细胞是否可以诱导其成为抑制肝癌细胞生长的M1型巨噬细胞，探讨是否与Stat-3信号通路有关。 方法：采用Ficoll-Pa...
- 王秦
- 关键词：肝癌巨噬细胞信号通路
- 内源性β干扰素维持M1型巨噬细胞极化状态抑制肝癌细胞增殖和侵袭被引量：2
- 2016年
- 目的研究内源性β干扰素(IFN-β)对M1型巨噬细胞极化状态及M1型巨噬细胞介导抗肝癌细胞增殖和侵袭的影响。方法体外建立单核系肿瘤细胞U937来源的M1巨噬细胞U937-M1模型,用实时定量PCR、ELISA及流式细胞术鉴定其表型。通过干扰IFN-β1基因或用抗体中和IFN-β,检测M1/M2巨噬细胞表型标志物表达的变化;用实时定量PCR和Western blot法检测干扰素调节因子1(IRF1)及IRF5的表达。收集不同处理组的U937-M1细胞培养上清为条件培养基(CM),分别培养Hep G2细胞及SMMC-7721细胞,用CCK-8法和TranswellTM侵袭实验分别检测CM对肝癌细胞增殖和侵袭的影响。结果与未激活型U937-M0细胞相比,U937-M1细胞白细胞介素12p35(IL-12p35)、IL-12p40、IL-12p70、IL-23p19、IL-6、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和CD86表达显著增强;而两组均低表达CD206。阻断內源IFN-β作用后,与U937-M1细胞相比,上述M1型巨噬细胞相关表型标志物表达明显减弱;反之,M2型巨噬细胞表型标志物IL-10和CD206表达增强;且IRF1及IRF5表达均减弱;阻断IFN-β作用后,M1型巨噬细胞对肝癌细胞增殖及侵袭的作用从抑制转变为促进。结论阻断內源IFN-β后,M1型巨噬细胞极化状态以及U937-M1介导抗肝癌效应受到抑制;IFN-β可能参与调节IRF1和IRF5的表达,维持M1型巨噬细胞极化状态和功能。
- 谢昌利郭变琴刘翠颖林艳吴碧涛王秦李紫微涂植光
- 关键词：增殖
- 卵巢癌相关抗原CA125单克隆抗体的制备
- 2013年
- 目的制备卵巢癌相关抗原CA125R单克隆抗体,并进行鉴定。方法将CA125一段串联重复序列(CA125R)基因克隆至原核表达载体pGEX-6P-1,构建重组表达质粒pGEX-CA125R,转化大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3),IPTG诱导表达GST-CA125R融合蛋白。表达的融合蛋白经GST亲和层析柱纯化后,免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备CA125单克隆抗体,Western blot法鉴定抗体的特异性,单克隆抗体亚类测定试剂盒分析单抗的亚类。腹水诱生法大量制备单抗,SDS-PAGE分析单抗的纯度,间接ELISA法检测单抗的效价。结果重组原核表达质粒pGEX-CA125R经双酶切及测序,证实构建正确;纯化的GST-CA125R融合蛋白相对分子质量约44 000,纯度约为95%,可与小鼠抗GST单克隆抗体发生特异性反应;获得1株可稳定分泌抗CA125单克隆抗体的杂交瘤细胞株3-B2,其分泌的单抗能特异识别GST-CA125R融合蛋白和天然CA125糖蛋白,其抗体亚型为IgG2a型;纯化的腹水单抗纯度约为90%,效价达1×106以上。结论成功获得1株能特异性识别天然CA125糖蛋白的单克隆抗体细胞株,并经腹水诱生法大量制备了抗体,为CA125临床检测试剂盒的研发奠定了基础。
- 梁勤东马婷婷董晋豫李武县汪先桃李紫微王秦熊海玉涂植光
- 关键词：卵巢癌肿瘤相关抗原CA125单克隆抗体
- 过表达IL-12调节单核系肿瘤细胞向巨噬细胞分化被引量：3
- 2014年
- 构建过表达白细胞介素-12(interleukin-12,IL-12)的THP-1单核系肿瘤细胞模型,从形态学、巨噬细胞表面标志表达水平及吞噬功能3方面探究过表达IL-12能否调节单核系肿瘤细胞向巨噬细胞分化。结果发现,与空白和空载组相比,IL-12组的THP-1细胞界限不明显,散在细胞增多;呈圆形或不规则圆形,偶见毛刺状突起;核仁模糊或消失,核染色质条索状浓集;CD68 mRNA和蛋白表达量均升高(P<0.05)。与空白组相比,CD11b mRNA和蛋白表达量升高不明显(P>0.05),但72 h CD11b蛋白表达量明显高于相同培养条件下的空载组(P<0.05)。培养72 h后各组细胞吞噬能力比较,IL-12组吞噬率(36.7±1.2)%高于空白组(15.7±3.1)%和空载组(28.0±1.5)%,差异有统计学意义(P<0.05)。上述结果提示,过表达IL-12可以促进单核系肿瘤细胞向巨噬细胞分化。
- 马婷婷熊海玉王秦成凤李紫薇吴碧涛林艳涂植光
- 关键词：过表达巨噬细胞
- 重组腺病毒Ad5-hNK4-EGFP的构建与鉴定被引量：3
- 2012年
- 目的构建携带绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)标签和hNK4基因的重组腺病毒Ad5-hNK4-EGFP,并检测其对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的影响。方法以pcDNA3/hNK4质粒为模板,采用高保真DNA聚合酶扩增hNK4基因,克隆至腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,构建重组穿梭质粒pAdTrack-hNK4,穿梭质粒经PmeⅠ酶切线性化,与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组,获得重组腺病毒质粒pAd5-hNK4-EGFP,经PacⅠ酶切线性化后转染AD-293细胞进行包装,获得重组腺病毒Ad5-hNK4-EGFP,经4轮扩增后,测定病毒滴度;将重组腺病毒感染AD-293细胞,采用RT-PCR及Western blot法检测感染细胞中NK4基因的转录及蛋白的表达;MTT法检测Ad5-hNK4-EGFP对肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor,HGF)诱导的MDA-MB-231细胞增殖的影响。结果重组腺病毒质粒pAd5-hNK4-EGFP经PacⅠ酶切鉴定证明构建正确;经包装及4轮扩增后,重组腺病毒Ad5-hNK4-EGFP的滴度可达1.5×1011PFU/ml;经RT-PCR及Western blot鉴定表明,重组腺病毒携带的NK4基因能够在AD-293细胞中表达;HGF可促进MDA-MB-231细胞增殖,而Ad5-hNK4-EGFP可拮抗HGF诱导的MDA-MB-231细胞增殖。结论成功构建了表达hNK4基因的重组腺病毒Ad5-hNK4-EGFP,其可拮抗HGF诱导的MDA-MB-231细胞的增殖,为进一步深入研究HGF和NK4的功能、相互作用及作用机制奠定了基础,也为乳腺癌的靶向基因治疗提供了一个新的靶点。
- 匡文斌成凤秦晓林范晓卿王秦董晋豫梁勤东涂植光
- 关键词：腺病毒肝细胞生长因子NK4
- Ad5F35-GFP、Ad5-GFP及Lipofectamine^(TM) 2000对4种细胞转染效率的比较被引量：2
- 2012年
- 目的将腺病毒Ad5F35-GFP、Ad5-GFP及LipofectamineTM2000对4种细胞的转染效率进行比较,以获得Ad5F35-GFP适用的细胞种类及各类细胞适用的转染方法。方法采用携带绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)基因的Ad5F35-GFP、Ad5-GFP及LipofectamineTM2000,分别转染人慢性粒细胞白血病细胞K562、人外周血单个核细胞(PBMC)、小鼠脂肪细胞3T3-L1和肝癌细胞Hep A1-6,于转染48 h后,倒置荧光显微镜下观察转染效率,RT-PCR法检测GFP基因mRNA的转录水平。结果 Ad5F35-GFP转染K562细胞、PBMC效率均较高,分别为61%和56%,但不能有效地转染3T3-L1(5%)、HepA1-6(15%)细胞;Ad5F35-GFP、Ad5-GFP及LipofectamineTM2000均不能有效地转染3T3-L1细胞,转染效率分别为5%、5%和6%;Ad5-GFP、LipofectamineTM2000转染Hep A1-6细胞效率均较高,分别为73%和71%。结论 Ad5F35-GFP可有效转染人造血细胞和单核细胞,为相关基因的研究及治疗领域的应用奠定了基础。
- 成凤王秦匡文斌李朴董晋豫梁勤东涂植光
- 关键词：腺病毒转染效率
- Y盒结合蛋白1单克隆抗体的研制、表位测定及其免疫学应用被引量：5
- 2012年
- 建立稳定分泌抗人Y盒结合蛋白1单克隆抗体(anti-YB-1 mAb)的杂交瘤细胞株,鉴定其表位与免疫学应用。将重组YB-1蛋白免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合。经ELISA法筛选鉴定、定株后采用腹水诱生法制备anti-YB-1 mAb;Protein G亲和层析法纯化mAb,ELISA法测定mAb效价、亚型及相对亲和力。采用抗原表位预测法鉴定anti-YB-1 mAb识别表位所在区域。Western blot和免疫组化鉴定mAb识别内源性YB-1的特异性。经筛选鉴定获得2株稳定分泌anti-YB-1 mAb的杂交瘤细胞(1-D9,3-E8);腹水抗体效价均≥1×10-6,亚型均为IgGl;1-D9和3-E8单抗识别表位分别位于(134-160aa)与(266-303aa)肽段。Western blot、免疫组化结果证实anti-YB-1 mAb能特异性识别内源性YB-1。该研究为YB-1免疫学定性、定量检测方法的建立、肿瘤靶向抗体治疗及进一步探讨YB-1的生物学功能奠定了基础。
- 李朴史静成凤梁勤东匡文斌王秦董晋豫涂植光
- 关键词：YB-1单克隆抗体抗原表位免疫学检测
- IL-12诱导急性单核细胞白血病细胞分化及凋亡的机制研究被引量：3
- 2015年
- 白细胞介素-12(interleukin-12,IL-12)具有明显的抗肿瘤作用,但其作用机制较复杂。前期形态学和功能的研究发现,IL-12可诱导单核细胞白血病细胞分化。该研究从巨噬细胞表面分化标志、细胞增殖能力、周期以及凋亡四个方面探讨了IL-12诱导急性单核细胞白血病细胞分化和凋亡的相关作用机理。结果发现,以人源性重组IL-12 p70处理的THP-1细胞,巨噬细胞表面标志CD68和CD11b的表达量明显增加并呈时间依赖性,CD68+和CD11b+阳性细胞数也显著增多;IL-12诱导分化过程中伴有THP-1细胞生长缓慢、G1期或G1/S期细胞周期阻滞现象;IL-12处理后的THP-1细胞凋亡率也明显增加,以早期凋亡细胞为主,并伴有抗凋亡蛋白Bcl-2表达下调及促凋亡蛋白Fas表达增加。上述实验结果提示,IL-12对于急性单核细胞白血病可通过诱导肿瘤细胞向成熟巨噬细胞分化,抑制细胞增殖以及增加细胞凋亡来发挥抗肿瘤作用。
- 吴碧涛马婷婷林艳熊海玉王秦成凤李紫薇涂植光
- 关键词：白细胞介素-12急性单核细胞白血病分化治疗
- 卵巢癌细胞与巨噬细胞共培养对B7-H1表达的影响及机制被引量：4
- 2013年
- 为了探讨卵巢癌细胞与巨噬细胞共培养后对B7-H1表达的影响及其可能机制,利用佛波酯(PMA)诱导THP-1或外周血单核细胞分化为巨噬细胞后,与人卵巢癌细胞株SKOV3体外非接触共培养24 h,qRT-PCR、Western blot以及流式细胞术分别检测SKOV3与巨噬细胞B7-H1的表达;进一步利用NF-κB、JAK2/STAT3、p38 MAPK信号通路的抑制剂作用于共培养体系,检测B7-H1表达的变化,以探讨其机制。结果显示,共培养24 h后,SKOV3及巨噬细胞B7-H1 mRNA和蛋白的表达较非共培养组均显著升高(P<0.05),而阻断NF-κB、JAK2/STAT3、p38 MAPK信号通路后,B7-H1的上调均明显被抑制(P<0.05)。SKOV3与巨噬细胞共培养后B7-H1的表达升高(P<0.05),其机制可能涉及到NF-κB、JAK2/STAT3、p38 MAPK信号通路的激活。
- 熊海玉马婷婷王秦董晋豫梁勤东李紫微张维理涂植光
- 关键词：卵巢癌B7-H1肿瘤相关巨噬细胞
- IL-12通过AKT／mTOR／STAT3信号通路诱导肝癌细胞自噬被引量：5
- 2016年
- 目的探讨白细胞介素12(IL-12)对Hep G2和SMMC-7721肝癌细胞自噬的影响及其可能的作用机制。方法 10 ng/m L的IL-12处理肝癌细胞6 h,通过Western blot法检测自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC-3)和Beclin 1以及相关信号通路蛋白:蛋白激酶B(AKT)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(m TOR)、信号转导子与转录激活子3(STAT3)磷酸化水平的变化,免疫荧光技术及透射电镜观察细胞自噬的发生情况;使用STATTIC或si STAT3抑制STAT3的活性以及胰岛素样生长因子1(IGF-1)活化AKT之后,再次观察IL-12诱导细胞自噬的变化情况。10 ng/m L的IL-12处理肝癌细胞1、2、3、4、5 d,CCK-8法检测细胞的增殖;10 ng/m L的IL-12处理肝癌细胞48 h,台盼蓝染色检测细胞死亡率;利用小干扰RNA(siRNA)沉默Beclin 1基因抑制自噬后,再次用CCK-8法和台盼蓝染色法检测IL-12对肝癌细胞增殖和死亡的影响。结果 IL-12能够诱导肝癌细胞发生自噬,抑制其增殖,降低其存活率;siRNA沉默Beclin 1基因后,细胞存活率降低;IL-12处理后p-AKT、p-m TOR、p-STAT3水平都显著降低;STATTIC预处理可增强IL-12诱导的细胞自噬,而IGF-1预处理后,IL-12诱导的细胞自噬减弱。结论 IL-12通过抑制AKT/m TOR/STAT3信号通路来诱导Hep G2和SMMC-7721肝癌细胞发生自噬,该自噬可减弱IL-12抑制肝癌增殖的能力。
- 刘翠颖谢昌利林艳吴碧涛王秦李紫薇涂植光
- 关键词：SMMC-7721细胞
