王海涛
- 作品数：7 被引量：8H指数：2
- 供职机构：内蒙古农业大学生命科学学院更多>>
- 发文基金：国家科技重大专项更多>>
- 相关领域：生物学农业科学更多>>
- 转拟蜘蛛牵丝蛋白基因新疆美利奴细毛羊成纤维细胞系的建立及初步鉴定被引量：1
- 2013年
- [目的]建立含有拟蜘蛛牵丝蛋白基因的新疆美利奴细毛羊成纤维细胞系。[方法]采用脂质体转染,将表达拟蜘蛛牵丝基因的质粒pKap-EGFP4S转入新疆美利奴细毛羊成纤维细胞,通过G418毒性筛选获得阳性细胞系,并采用PCR、RT-PCR检测重组细胞中的目的基因表达。[结果]对体外分离培养的成纤维细胞观察表明细胞形态均为长梭形、活性良好(细胞生长曲线呈S型)、染色体数目为2n=54;通过G418筛选出共43株单克隆细胞系,经PCR鉴定拟蜘蛛牵丝蛋白基因随机整合的细胞系15株,其中挑选4个阳性细胞系经过RT-PCR检测目的基因已转录为mRNA。[结论]成功建立了拟蜘蛛牵丝蛋白基因的新疆美利奴细毛羊成纤维细胞系,为进一步通过体细胞核移植技术制备被毛含转拟蜘蛛牵丝蛋白基因克隆羊奠定基础。
- 房君孟凡华王海涛周欢敏
- 关键词：脂质体转染
- CIDR放置时间、不同饲养管理模式、重复超数排卵及发情时间对绵羊超数排卵的影响被引量：4
- 2014年
- 本试验旨在研究绵羊孕酮控制释放器(CIDR)放置时间、不同饲养管理模式、重复超数排卵次数及超数排卵后发情时间对绵羊超数排卵的影响。CIDR放置不同时间结果显示,第10天起针组的平均可用胚胎数(P<0.05)、胚胎可用率(P<0.01)均高于第13天起针组;不同饲养管理模式结果显示,舍饲羊平均可用胚胎数、胚胎可用率极显著高于放牧羊(P<0.01);不同次数超数排卵结果显示,第2次超数排卵效果好于其他5次,与第3次之间差异不显著(P>0.05),与其他4次之间差异显著(P<0.05);通过比较绵羊超数排卵后发情效果发现,绵羊超数排卵后发情24h的胚胎利用效果最佳。综上所述,CIDR放置时间、不同饲养管理模式、重复超数排卵次数对供体绵羊超数排卵效果的影响极显著,且供体绵羊超数排卵后发情24h的胚胎利用效果最佳。
- 王峰王申元张仙保周利军张东刘彩云王海涛刘羿羿潘静韩利东周欢敏张立
- 关键词：CIDR饲养管理重复超数排卵绵羊
- 拟蜘蛛牵丝蛋白基因细毛羊毛囊特异表达载体的构建及其转基因细胞系的建立
- 蜘蛛丝是自然界具有最优异力学性能的生物纤维，主要成分为蛛丝蛋白，但是难以大量生产或收集。利用基因工程手段可实现蛛丝蛋白基因转入异源宿主中并表达。本实验通过脂质体转染法将蜘蛛牵丝蛋白基因真核表达载体pK-2S转入美利奴细毛...
- 王海涛
- 关键词：纤维细胞蛛丝蛋白蛋白结构基因表达
- 文献传递
- 绵羊角蛋白Kap6.1启动子的克隆及活性检测被引量：2
- 2012年
- 克隆绵羊角蛋白Kap6.1启动子,为下一步构建真核毛囊特异表达载体奠定基础。以绵羊基因组为模板,利用PCR方法克隆绵羊角蛋白结合蛋白Kap6.1启动子,并用此启动子置换真核表达载体pEGFP-N1的原始启动子CMV,构建pKap-EGFP质粒,通过转染内蒙古阿尔巴斯绒山羊胎儿皮肤成纤维细胞鉴定启动子活性。结果显示:克隆所获得的启动子序列与NCBI上发表序列匹配率为99.6%,启动子的特征序列CAAT框和TATA框完整,并且分别位于序列的921位和878位,pKap-EGFP质粒转染绒山羊成纤维细胞后Kap能启动GFP的表达,与对照组相比活性良好。本研究通过克隆获得了绵羊角蛋白结合蛋白Kap6.1启动子,并观测到其能启动GFP在山羊胎儿皮肤成纤维细胞中表达。
- 孟凡华王海涛房君邢燕平周欢敏
- 关键词：启动子克隆转染
- 牛偏爱密码子优化后的Beta蛋白多克隆抗体制备
- 2015年
- 本研究旨在优化λ噬菌体bet基因,使其能够在牛细胞中高效表达,通过密码子优化及全基因合成方法制备牛bet基因,并进行原核表达和多克隆抗体制备及抗体效价评估。从GenBank中获得λ噬菌体bet基因的序列,登录号为AP005153,用牛偏爱密码子对其进行优化并将其合成。根据优化后的基因序列设计引物,用PCR扩增优化后的bet基因,随后将其克隆到pET28原核表达载体,并转化入大肠杆菌BL21中进行诱导表达。表达的蛋白产物利用亲和层析的方法进行纯化,用His tag的抗体进行Western blot鉴定。用纯化后的蛋白免疫CD1小鼠,得到抗Beta蛋白的血清,通过ELISA测定该多克隆抗体的滴度。结果表明:通过双酶切和测序,成功挑选出正确的原核表达质粒pET-bet;SDS-PAGE,电泳结果显示融合蛋白表达成功;用纯化后的蛋白免疫试验鼠后得到多克隆抗体,经Western blot检测,该多克隆抗体能与His-Beta融合蛋白特异性结合;经ELISA方法检测该多克隆抗体的滴度为1∶41 700。成功地制备了Beta蛋白的多克隆抗体,为深入探索bet基因的生物学功能和在牛及大型哺乳动物中的应用奠定了基础。
- 齐昱邢燕平周欢敏房君钱呈王海涛
- 关键词：密码子优化原核表达蛋白纯化多克隆抗体
- 拟蜘蛛牵丝蛋白基因细毛羊毛囊特异表达载体的构建及其转基因细胞株的筛选被引量：2
- 2014年
- 试验旨在获得具有毛囊表达特性的转蜘蛛牵丝蛋白基因细胞株。根据GenBank上发表的棒络新妇属蜘蛛的cDNA片段合成拟蜘蛛牵丝蛋白基因单体S,加倍后连入pEGFP-N1框架载体以构建真核表达载体pK-2S,转染新疆美利奴细毛羊皮肤成纤维细胞后筛选单克隆,并通过PCR在DNA、RNA水平检测阳性克隆。基因合成后测序结果显示序列正确,酶切得到正确目的条带,筛选出阳性克隆并且可以在基因组及cDNA上扩增出目的片段。本研究成功将蜘蛛牵丝蛋白基因转入新疆美利奴细毛羊细胞,并在RNA水平表达,为培育毛囊特异表达蜘蛛牵丝蛋白基因并具有更高机械性能羊毛的新型细毛羊品种奠定基础。
- 王海涛孟凡华房君周欢敏
- 关键词：细毛羊
- 拟蜘蛛牵丝蛋白基因单体(S)原核表达及多克隆抗体制备被引量：1
- 2013年
- 利用原核表达获得的拟蜘蛛牵丝蛋白制备多克隆抗体,将为我们在真核水平检测其表达情况奠定基础。以质粒pGEX-2T为骨架载体,在其多克隆位点处连接人工合成的拟蛛丝蛋白基因单体(S),构建含有GST标签的融合蛋白原核表达载体pGEX-S;利用IPTG诱导重组质粒pGEX-S在大肠杆菌感受态细胞BL21中表达,并利用GST标签亲和纯化重组蛋白,获得的S-GST蛋白与佐剂混合后,采用多点皮下免疫注射8只健康的CDⅠ小白鼠,免疫期结束后收集抗血清进行ELISA检测。序列分析后,确定原核表达载体pGEX-S编码正确;诱导表达后,Western blot检测显示在41 kD处有重组蛋白条带出现,与我们预期的结果相符;抗血清Elisa检测显示有2只小鼠A和F抗血清效价较高。采用原核表达生产的拟蜘蛛牵丝蛋白成功制备了多克隆抗体。
- 孟凡华房君王海涛邢燕平齐昱周欢敏
- 关键词：原核表达多克隆抗体
