李建彬
- 作品数：11 被引量：12H指数：3
- 供职机构：军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家高技术研究发展计划国家重点实验室开放基金更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- 利用移码突变和终止密码子提高下游目的基因的表达水平被引量：3
- 2011年
- 目的:在基因结构复杂的慢病毒载体插入报告基因并提高目的基因表达量。方法:慢病毒载体上有复杂的基因排列,为了不影响慢病毒载体的活性,必须尽量保留原有的基因,替换不必要的基因。首先将报告基因萤光素酶插入慢病毒载体替换基因Env后,结果检测不到报告基因的表达。为了提高报告基因的表达水平,将报告基因的读码框向后移动一个碱基,同时在其上游增加一个终止密码子,然后检测报告基因的表达水平。结果:通过移动报告基因的读码框同时在上游增加终止密码子,使报告基因的表达水平大大提高。结论:在构建基因表达载体时,通过改变目的基因与上游起始密码子ATG之间的相对位置以及增加终止密码子,可以大幅提高目的基因的表达水平。
- 陈斌李建彬米志强安小平李存刘大斌姜焕焕王娟黄芬张宝中范华昊何后军童贻刚
- 关键词：慢病毒载体报告基因基因表达定点突变
- 快速从医院废水中大规模分离铜绿假单胞杆菌噬菌体被引量：4
- 2012年
- 目的:从医院废水中快速分离多株不同的铜绿假单胞杆菌噬菌体,研究其生物学特性,为建立铜绿假单胞杆菌噬菌体库做准备。方法:利用噬菌斑法从未经处理的医院污水中分离和鉴定铜绿假单胞杆菌噬菌体,根据感染谱的不同确定它们为不同的铜绿假单胞杆菌噬菌体;重点研究其中一株宿主谱较广的噬菌体的生物学特性,采用负染法电镜观察噬菌体的形态和大小,提取该噬菌体的基因组并进行酶切电泳分析,测定噬菌体感染复数并观察其一步生长曲线。结果:通过噬菌斑法分离出90株铜绿假单胞杆菌噬菌体。电镜观察显示,噬菌体Pa27P1头部呈立体对称,有一长尾;酶切结果显示,噬菌体Pa27P1的基因组为双链DNA;生长曲线表明噬菌体Pa27P1感染宿主菌的潜伏期为25 min,爆发时间为25 min,裂解量为514。结论:90株铜绿假单胞杆菌噬菌体中有5株具有较广的噬菌谱,其组合能裂解所有18株铜绿假单胞杆菌,为深入研究铜绿假单胞杆菌噬菌体的生物学特性及其功能提供了依据。
- 范华昊范俊芬滑玉会裴广倩张文惠张博陈晨李建彬王晓娜安小平米志强王琳尹秀云陈建魁童贻刚
- 关键词：细菌耐药生物学特征
- 利用高通量测序快速检测疑似感染患者体内未知病原体被引量：3
- 2011年
- 采用第二代高通量测序技术从复杂的疑似感染患者组织标本中直接快速检测未知病原体。方法:取临床和实验室均不能确诊的病人血液和淋巴组织,进行病毒DNA和RNA的提取,直接用于第二代高通量测序,将测序结果用于生物信息学分析,与本地化的病毒核酸数据库进行比对,寻找潜在的病毒序列。结果:生物信息学分析显示,3901条序列reads与人内源性病毒K113同源;当使用K113特异性引物对经过DnaseI处理的患者和正常个体进行荧光定量RT-PCR时,发现在患者体内K113病毒基因的表达远远高于正常个体,提示该患者可能存在K113病毒的感染。结论:第二代高通量测序可能用于快速检测未知病原体。
- 李建彬庄璐安小平米志强范华昊李存陈斌刘玮鲍一丹罗征秀刘恩梅方祥童贻刚
- 关键词：高通量测序
- 从大容量噬菌体抗体库中筛选抗Acr蛋白人源单链抗体
- 2012年
- 目的:从天然的大容量噬菌体抗体库中筛选特异的抗结核分枝杆菌晶体蛋白(alpha-crystallin Acr)的人源抗体。方法:以结核分枝杆菌Acr蛋白包被免疫管,通过对噬菌体抗体库进行4轮"吸附-洗脱-扩增"的过程从大容量抗体库中筛选特异性抗结核分枝杆菌Acr蛋白的抗体,并对可变区序列进行了测序分析。将特异性的噬菌体抗体感染HB2151菌,经IPTG诱导表达,制备了抗结核分枝杆菌Acr蛋白的可溶性单链抗体;对其序列和抗原结合活性进行分析鉴定。结果:经过4轮筛选,获得了43个与结核分枝杆菌Acr蛋白结合的阳性克隆,其中29个特异结合的克隆;测序分析有26不同的可变区片段;通过可溶性单链抗体(scFv)表达筛选到14株特异性结合Acr蛋白的可溶性单链抗体克隆;经过基因测序,分析了可变区基因的亚群。成功制备了可溶性单链抗体。Westren blotting分析证实筛选的人源单链抗体能与天然蛋白结合。结论:利用单链大容量抗体库获得抗结核分枝杆菌Acr蛋白的噬菌体抗体并且成功制备抗结核分枝杆菌Acr天然蛋白的可溶性单链抗体,为今后的研究和应用奠定基础。
- 王晓娜米志强安小平李建彬范华昊张文慧张博黄勇周丽君童贻刚
- 关键词：ACR蛋白噬菌体抗体库单链抗体
- 基孔肯雅病毒囊膜蛋白假病毒模型的构建
- 2011年
- 目的:以HIV为骨架构建单次复制性的含基孔肯雅病毒囊膜蛋白的假病毒模型,观察其对哺乳动物细胞的侵染性。方法:PCR合成基孔肯雅病毒囊膜蛋白基因,克隆到真核表达载体上,与HIV慢病毒包装系统质粒共转染293FT细胞,48 h后收培养上清,在8μg/mL Polybrene存在下感染293FT细胞,感染48 h后在荧光显微镜下观察结果。结果:PCR合成了基孔肯雅病毒囊膜蛋白基因并克隆到真核表达载体上,测序结果正确;共转染293FT细胞后,检测到基孔肯雅病毒囊膜蛋白的表达并包装成假病毒,感染新鲜293FT细胞后能够检测到绿色荧光蛋白。结论:合成的基孔肯雅病毒囊膜蛋白基因能正确表达并包装成假病毒,含基孔肯雅病毒囊膜蛋白的假病毒能感染293FT细胞并表达绿色荧光蛋白,可用该假病毒模型进一步研究基孔肯雅病毒的感染性,筛选评价抗基孔肯雅病毒药物。
- 王晓娜安小平范华昊王娟李建彬刘大斌姜焕焕米志强童贻刚
- 关键词：感染性
- 结核分枝杆菌16-kDa α晶体蛋白的原核表达及纯化
- 2012年
- 目的:利用基因工程技术原核表达并纯化结核分枝杆菌α晶体蛋白(Acr)。方法:以结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA为模板,通过PCR方法扩增Acr的编码基因,以pCold为载体构建重组质粒,再转化到表达宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达,经SDS-PAGE和Western印迹分析和纯化该表达产物。结果:构建了具有正确基因序列的Acr重组表达质粒,重组Acr在大肠杆菌BL21(DE3)中经低温诱导得到可溶性表达;分别用6×His的单克隆抗体和16-kDa单克隆抗体对表达产物进行Western印迹分析,结果显示在相对分子质量约19 000处均有特异性条带,与预计大小吻合;纯化后蛋白纯度达90%,浓度达0.8 mg/mL。结论:表达了重组可溶性Acr,为深入研究该蛋白的生物学、免疫学活性奠定了基础。
- 王晓娜刘大斌安小平李存李建彬范华昊张文慧张博米志强童贻刚
- 关键词：结核分枝杆菌原核表达纯化
- 基孔肯雅病毒非结构蛋白基因合成中多位点缺失突变的校正方法
- 2011年
- 目的:建立一种PCR方法,以快速校正基孔肯雅病毒非结构蛋白基因合成过程中发生的多位点缺失突变。方法:用PCR方法合成基孔肯雅病毒非结构蛋白基因;对测序的克隆进行序列比对,分析不同克隆上缺失突变发生的位置,以保守区域互相重叠的寡核苷酸为上下游引物、以该区域测序正确的克隆为模板进行PCR扩增,得到所需片段,再将这些片段用PCR方法进一步组装成完整的基因序列并进行测序。结果:测序结果表明,经过2次PCR扩增,校正了基孔肯雅病毒非结构蛋白基因合成过程中发生的5个位点缺失突变。结论:得到序列正确的基孔肯雅病毒非结构蛋白基因。在进行基因合成过程中如发生多位点缺失突变,可利用该方法同时对以上突变进行校正,无须再合成引物,降低了实验操作难度,并提高了实验效率。
- 范华昊王娟安小平王晓娜李建彬陈斌李存米志强童贻刚
- 关键词：基孔肯雅病毒非结构蛋白基因基因合成
- 利用高通量测序快速检测疑似感染患者体内未知病原体
- 目的 采用第二代高通量测序技术从复杂的疑似感染患者组织标本中直接快速检测未知病原体。方法 取临床和实验室均不能确诊的病人血液和淋巴组织,进行病毒DNA和RNA的提取,直接用于第二代高通量测序,将测序结果用于生物信息学分析...
- 李建彬童贻刚庄璐安小平米志强范华昊李存陈斌刘玮刘恩梅
- 关键词：高通量测序
- 以HIV-1 5'LTR为靶点的药物筛选细胞模型的构建被引量：1
- 2011年
- 构建以人类免疫缺陷病毒(HIV-1)5'LTR为靶点的药物筛选细胞模型,用于体外筛选潜在的对HIV-1启动子具有抑制作用的药物,或用于筛选与HIV-1复制相关的宿主因子。通过PCR扩增HIV-1 5'LTR片段和胸苷激酶基因(thymidine kinase gene,TK基因),以这2片段为模板进行重叠PCR将两者连接起来,连接产物经酶切后与pcDNA3.1载体连接;将连接正确的质粒转染HEK293细胞同时用G418加压筛选获得稳定细胞系;加入药物更昔洛韦(GCV)检测TK基因的表达。成功构建了HIV-1 5'LTR调控TK基因表达的稳定细胞系,在其培养过程中加入药物更昔洛韦时,细胞逐渐死亡。构建了以HIV-1 5'LTR为靶点的药物筛选细胞模型,该模型利用TK基因作为报告基因方便灵敏,可用于筛选针对HIV-1 5'LTR的潜在抗HIV药物。
- 李建彬陈斌米志强安小平李存刘大斌王晓娜范华昊方祥童贻刚
- 关键词：HIVLTR药物筛选
- shRNA随机文库结合TK自杀基因筛选靶向HIV-1 LTR相关宿主因子
- 2012年
- 构建shRNA随机文库与HIV-1 LTR启动胸苷激酶基因(TK基因)稳定表达的稳定细胞系HEK293/TK,将两者结合起来,筛选靶向HIV-1 LTR相关宿主因子。方法:通过化学合成含有19个随机脱氧核苷酸的发夹结构,将其退火补平后与合成的接头Linker连接进行PCR反应,将PCR产物酶切后置于慢病毒载体pLenti-U6启动子下游由此构建shRNA随机文库;利用重叠PCR将HIV-1 LTR片段和TK基因连接起来,连接产物经酶切后与pcDNA3.1载体连接;将连接正确的质粒转染HEK293细胞同时用G418加压筛选获得稳定细胞系HEK293/TK;将所获得的文库质粒包装成慢病毒后侵染所构建的HEK293/TK细胞系,通过加入药物GCV进行加压筛选获得存活细胞。结果:成功筛选到加药后存活下来的细胞,抽提细胞基因组,采用巢式PCR扩增目的干扰序列并用Western blot对干扰序列进行验证,鉴定获得一个克隆所表达的shRNA能对TK基因的表达起到抑制作用,通过测序分析获得其干扰序列,该序列很有可能针对HIV-1 LTR某宿主相关因子。结论:成功构建了一种筛选HIV-1 LTR相关宿主因子的方法,筛选所得序列可以定位到具体相关宿主因子,为靶向筛选抗HIV-1药物提供了重要手段。
- 李建彬米志强安小平谭莉陈斌王晓娜范华昊张文慧张博方祥童贻刚
- 关键词：慢病毒载体
