谢星星
- 作品数：19 被引量：28H指数：3
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- 检测坦布苏病毒的双抗体夹心ELISA方法建立及初步应用被引量：3
- 2014年
- 以鹅源坦布苏病毒JS804毒株制备的多克隆抗体为捕获抗体,抗鹅坦布苏病毒NS1蛋白的单克隆抗体4A9作为检测抗体,建立了检测坦布苏病毒的双抗体夹心ELISA方法。该方法的最佳反应条件为:兔抗鹅坦布苏病毒多克隆抗体的最适稀释度为1∶1 600,单克隆抗体的最适稀释度为1∶160,样品反应时间为1 h,酶标羊抗鼠二抗工作浓度为1∶5 000,以OD450nm≥0.245作为阳性判定标准。该方法的板间、板内重复性变异系数小于10%,病毒最低检测量为386.25TCID50/0.1 mL,与新城疫病毒(NDV)、禽流感病毒(AIV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、鸭肝炎病毒(DHV)和鹅细小病毒(GPV)无交叉反应。应用该方法与RT-PCR方法同时检测22份临床样品,符合率达到86.36%。结果表明,建立的双抗体夹心ELISA方法具有特异性好、灵敏性高和重复性好等优点,可用于坦布苏病毒的快速检测。
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- 关键词：双抗体夹心ELISA
- 鸭坦布苏病毒囊膜蛋白抗原表位的串联表达与抗原性分析被引量：2
- 2015年
- 在对鸭坦布苏病毒囊膜蛋白抗原表位分析的基础上,将已经筛选出的8条抗原性良好的多肽采用柔性肽拼接,转入T载体中。将酶切回收的串联基因(命名为TEM)克隆于表达载体p ET32a中,获得重组表达质粒p ET32a-TEM,将该质粒转化于感受态细胞BL21(DE3)中,经IPTG诱导后进行超声裂解,对融合蛋白进行可溶性分析、Western blotting分析和免疫原性分析。重组质粒p ET32a-TEM的酶切和测序结果表明,TEM串联基因已成功插入到p ET32a原核表达载体中;表达的p ET32a-TEM融合蛋白分子质量约为38 000,以包涵体形式存在。Western blotting和小鼠免疫试验结果显示,p ET32a-TEM融合蛋白与鸭坦布苏病毒阳性血清能发生特异性反应,具有良好的抗原性。串联多肽的成功表达,将为鸭坦布苏病血清学检测方法建立、新型工程疫苗的研发奠定基础。
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- 关键词：合成多肽抗原性
- 鹅坦布苏病毒E蛋白质结构域I和Ⅱ在大肠杆菌中的表达及鉴定被引量：1
- 2014年
- 为了实现鹅坦布苏病毒E蛋白质结构域I和II在大肠杆菌中的表达。利用PCR方法扩增得到目的片段,并引入FLAG标签序列(DYKDDDDK),构建重组表达质粒pET28a-E-I/II。转化至BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达目的蛋白质,并对其进行SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定。结果显示,PCR扩增得到约900 bp的目的片段,经鉴定成功构建重组表达载体pET28a-E-I/II。重组菌在IPTG诱导4 h后在37 000处出现目的蛋白质并且表达量达到高峰。经超声波破碎后SDS-PAGE分析显示,融合蛋白质以包涵体形式存在。Western-blot结果显示,重组蛋白质与FLAG单抗和E蛋白质阳性血清均可发生特异性反应。表明鹅坦布苏病毒E蛋白质结构域Ⅰ和Ⅱ在大肠杆菌中成功表达,经鉴定重组蛋白质具有良好的免疫反应性。
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- 关键词：大肠杆菌DOMAINS
- 检测坦布苏病毒病抗体 NS1-ELISA方法的建立与初步应用被引量：8
- 2014年
- 为建立快速检测鸭坦布苏病毒病抗体的血清学方法,本研究利用鹅坦布苏病毒JS804株非结构蛋白NS1基因序列将其克隆至原核表达载体pET32a上,建立重组表达pET32a-NS1,转化至BL21(DE3)中。经IPTG诱导得到NS1融合蛋白,融合蛋白均以包涵体形式存在,包涵体经过变性和复性,纯化的坦布苏病毒NS1蛋白作为包被抗原,在最佳检测条件基础上,建立了检测坦布苏病毒病(Tembusu virus disease,简称TVD)抗体的间接ELISA方法。结果在条件优化后抗原最适包被量为1.925μg·孔-1,抗原最佳包被条件为37℃放置1 h后4℃过夜,血清的最佳稀释度为1∶200,最佳封闭时间为1 h,酶标二抗最适稀释度为1∶1 000,显色时间10 min。阴阳性临界值判定标准为0.346。用建立的间接ELISA方法检测禽流感、新城疫、传染性支气管炎、TVD阳性血清样品均无交叉反应,表明该方法具有良好的特异性。板内和板间重复试验的最大变异系数分别为6.7%和8.2%,显示该方法具有很好的稳定性。用间接NS1-ELISA方法对81份疑似鸭坦布苏病毒病血清样品进行检测,有43份样品呈现阳性,E-ELISA有48份呈阳性结果,证明该方法具有较高的敏感性。NS1-ELISA方法的建立为TVB的诊断和流行病学调查提供了一种新的方法。
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- 关键词：NS1蛋白间接ELISA抗体
- 鹅坦布苏病毒非结构蛋白NS5的原核表达及特性分析
- 本试验通过在大肠杆菌中表达鹅坦布苏病毒非结构蛋白NS5,对其纯化并进行特性分析。根据鹅坦布苏病毒JS804株非结构蛋白NS5基因序列,设计1对特异性引物,利用PCR技术扩增得到全长NS5基因序列,并将其定向克隆至原核表达...
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- 关键词：原核表达
- 文献传递
- 大肠杆菌中表达鹅坦布苏病毒NS1蛋白及纯化
- 根据鹅坦布苏病毒JS804 株非结构蛋白NS1 基因序列,设计一对特异性引物,利用PCR 方法扩增得到完整的NS1 基因,并将其克隆至原核表达载体pET28a 和pET32a 上,构建出重组表达质粒pET28a-NS1和...
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- 鹅新型坦布苏病毒囊膜蛋白的二级结构与B细胞表位预测被引量：2
- 2014年
- 以鹅坦布苏病毒（ goose Tembusu virus ， GTMUV ）的囊膜蛋白基因序列为基础，采用 Chou -Fasman 法、Garnier-Robson法和Karplus-Schulz法预测蛋白质的二级结构，采用Kyte -Doolittle 方案、Emini 方案和Jameson -Wolf方案预测鹅坦布苏病毒囊膜蛋白的B细胞表位。结果表明，鹅坦布苏病毒囊膜蛋白肽链的35～41、80～89、148～159、245～251、314～320、392～402和475～482区段为预测的B细胞表位优势区。综合研究结果，利用多参数方案综合预测E蛋白的B细胞抗原表位为进一步鉴定表位及设计疫苗奠定了基础。
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- 关键词：囊膜蛋白B细胞表位
- 双抗体夹心ELISA检测坦布苏病毒方法的建立及初步应用
- 以鹅坦布苏病毒JS804毒株制备的多克隆抗体为捕获抗体,抗鹅坦布苏病毒NS1蛋白的单克隆抗体4A9作为检测抗体,建立了检测坦布苏病毒的双抗体夹心ELISA方法.该方法的最佳反应条件为:兔抗鹅坦布苏病毒多克隆抗体的最适稀释...
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- 关键词：单克隆抗体
- 文献传递
- 坦布苏病毒E蛋白结构域Ⅰ/Ⅱ蛋白抑制病毒感染的研究
- 引言 鹅坦布苏病毒(GTMUV)属于黄病毒科、黄病毒属，给我国鸭鹅养殖业造成了重大经济损失.病毒囊膜蛋白E (E蛋白)是黄病毒属病毒表面最重要的结构蛋白，在空间上形成3个不同的结构域(Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ).E蛋白在吸附宿主、与宿...
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- 鹅源坦布苏病毒 RT-LAMP快速检测方法的建立被引量：8
- 2014年
- 坦布苏病毒是新发现的一种可引起家禽产蛋和采食量下降及死亡的黄病毒属病毒。根据GenBank中登录的鹅源坦布苏病毒NS5基因序列,利用Primer Explorer V4软件在序列保守区域设计1套特异识别NS5基因序列中6个不同区段的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)引物,并以此套引物建立一种基于LAMP技术的鹅源坦布苏病毒检测方法。结果表明,该方法灵敏度极高,是普通PCR方法的100倍,只能特异性扩增坦布苏病毒的RNA,对于其他常见禽RNA病毒均无特异性扩增。在反应体系中加入SYBR GreenⅠ染料后,通过肉眼观察有无绿色荧光可直接判定结果。该方法特异性强,灵敏度高,无需特殊仪器,简便,快速,适用于鹅源坦布苏病毒的临床快速检测。
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- 关键词：环介导等温扩增
