代晨
- 作品数：10 被引量：23H指数：4
- 供职机构：西北农林科技大学动物科技学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家高技术研究发展计划家畜疫病病原生物学国家重点实验室开放基金更多>>
- 相关领域：农业科学生物学更多>>
- 猪瘟病毒囊膜蛋白E2基因真核分泌型表达载体的构建及其表达被引量：4
- 2009年
- 【目的】构建猪瘟病毒囊膜蛋白(E2 protein)基因的真核表达载体,并将其在猪脐静脉血管内皮细胞中进行表达。【方法】采用PCR技术扩增出E2蛋白全长基因(E2qc)序列和去除跨膜基因(E2sh)序列,并将其克隆入真核表达载体pSecTag2(A)中,构建pSecTag-E2qc和pSecTag-E2sh表达载体,分别进行PCR、双酶切及测序鉴定。用脂质体法将阳性克隆瞬时转染猪脐静脉血管内皮细胞,对转染细胞进行RT-PCR检测目的基因的转录情况,同时对转染细胞及细胞上清液进行SDS-PAGE和Western-blot分析,以检测目的蛋白的表达情况。【结果】成功克隆了E2蛋白基因全长序列1119bp和去除E2蛋白跨膜基因序列999bp的目的基因。构建的表达载体经PCR、双酶切法及测序鉴定均无误。转染后细胞的RT-PCR结果显示,目的基因被成功转录。转染后细胞及细胞上清液的SDS-PAGE和Western-blot结果显示,目的基因被成功表达。【结论】成功构建了猪瘟病毒E2蛋白的真核表达载体,转染猪脐静脉血管内皮细胞后,分泌表达了猪瘟病毒E2重组蛋白。
- 徐彦召张彦明何雷唐青海代晨王静杨小云
- 关键词：真核表达
- 猪静脉血管内皮细胞系及其建立方法
- 本发明公开了猪静脉血管内皮细胞系(ZYM－SVEC01)，该细胞系于2008年9月26日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No.C200841。该细胞系是从猪的原代静脉血管中分离培养，采用脂质体转染法将...
- 张彦明王文秀代晨洪海霞苏正元马泉荔
- 文献传递
- 融合猪瘟病毒非编码区报告基因载体构建和表达及其亚克隆筛选
- microRNA（miRNA）是一种调节性的非编码小分子RNA,在不同的调节途径中发挥着关键性的作用。microRNA通过完全或者不完全的碱基配对与靶标分子mRNA的非编码区结合,从而在转录后水平进行引起靶mRNA的剪切...
- 代晨
- 关键词：猪瘟病毒报告基因MICRORNA转染
- 文献传递
- 猪血管内皮细胞中与猪瘟病毒相关microRNA的初步筛选被引量：4
- 2010年
- 本试验旨在筛选猪脐静脉血管内皮细胞(SUVECs)内作用于猪瘟病毒(CSFV)的microRNA。通过构建CSFV3′和5′非翻译区(Untranslated region,UTR)的双荧光素酶报告基因载体,经生物信息学预测可能与CSFV相互作用的microRNA,然后瞬时共转染重组载体与microRNA的抑制物,最后通过发光检测仪测定荧光素酶活性。结果表明,成功构建了CSFV5′非翻译区(373 bp)和3′非翻译区(252 bp)的报告基因载体,并合成了4条预测出的microRNA(ssc-mi R-let7c、ssc-mi R-106a、ssc-mi R-18、ssc-mi R-139)的抑制物,共转染后发光检测仪检测到荧光素酶的活性被不同程度抑制。本研究发现microRNA作用位点主要在CSFV的3′-UTR,而且以上4种microRNA都对CSFV3′-UTR有不同程度的抑制作用,其中ssc-mi R-18的抑制作用比较明显。
- 侯勃张彦明朱晓娟康恺代晨唐青海
- 关键词：猪瘟病毒MICRORNA
- 共表达猪瘟病毒E2基因和猪白细胞介素2基因的重组腺病毒的构建及其免疫原性研究被引量：10
- 2010年
- 为研制猪瘟活载体疫苗,构建共表达猪瘟病毒E2基因和猪白细胞介素2基因的重组腺病毒并研究其免疫原性。应用PCR方法从pMD19-T-E2质粒和pMD19-T-pIL2质粒中分别扩增E2基因和pIL-2基因,将扩增的全长E2基因和pIL-2的编码区基因序列通过柔性接头序列(5个甘氨酸密码子)串联,插入腺病毒穿梭载体AdTrack中,在受体菌中与骨架载体AdEasy同源重组。重组质粒AdEasy-E2-pIL-2转染HEK293细胞,包装出重组腺病毒rAd-E2-pIL-2。用rAd-E2-pIL-2免疫家兔,经兔体交互免疫试验评定其免疫效果。结果显示,经RT-PCR和West-ern blot检测,成功构建了rAd-E2-pIL-2,重组病毒滴度达108.12PFU/mL。rAd-E2-pIL-2接种家兔后刺激接种兔产生猪瘟病毒特异性抗体,淋巴细胞转化试验结果显示猪瘟病毒诱导兔淋巴细胞特异性增殖,攻毒后rAd-E2-pIL-2接种兔和猪瘟病毒C株接种兔均未出现定型热反应。研究结果表明,rAd-E2-pIL-2免疫兔可以预防猪瘟病毒C株接种引发的体温反应,rAd-E2-pIL-2可望成为猪瘟候选疫苗。
- 何雷张彦明徐彦召唐青海王静杨小云代晨向华常鹏祥林鸷
- 关键词：猪瘟病毒E2基因猪白细胞介素2重组腺病毒
- TGF-β1诱导SUVEC向平滑肌样细胞转分化的初步研究
- 2007年
- 用不同浓度TGF-1β对猪脐静脉血管内皮细胞(SUVEC)进行诱导,研究体外诱导SUVEC向平滑肌细胞分化的可能性。倒置显微镜下观察诱导前后细胞形态的变化,并采用免疫细胞化学SP法对细胞表面特异性标志物进行染色。结果表明,诱导后细胞失去内皮细胞典型的铺路石样形态,而呈现出肌成纤维样细胞;对诱导后的细胞进行免疫组化检测,发现5～10ng.mL-1 TGF-1β诱导后,平滑肌特异性蛋白-αSMA的相对表达量均显著升高;而浓度升高为20 ng.mL-1时,升高不显著;内皮细胞特异性标志(F-ⅧRAg)的表达均显著下降。该研究表明TGF-1β可诱导猪脐静脉血管内皮细胞向肌样细胞分化,但诱导分化的能力与TGF-1β的浓度有关。
- 王文秀张彦明熊奎州张浩邓文代晨
- 关键词：脐静脉血管内皮细胞转化生长因子Β1转分化平滑肌样细胞
- 表达miR-150shRNA细胞株的初步建立被引量：1
- 2009年
- 为了探讨融合microRNA重组干扰载体构建的方法,为今后mi R-150对猪瘟病毒(CSFV)潜在的调控进行研究,利用生物信息学技术筛选出mi R-150,设计并合成了表达mi R-150的两条shRNA序列的DNA单链,将其退火后与干扰载体pGenesil-1连接,构建了含有mi R-150shRNA和绿色荧光蛋白基因的重组干扰质粒pGene-mi R-150shRNA,提取并纯化质粒后,采用脂质体法将重组质粒转染PK-15细胞,用G418抗性筛选。经过酶切鉴定和测序鉴定,表明成功构建了重组干扰质粒pGene-mi R-150shRNA,并在转染24 h后即可检测到绿色荧光。本研究成功得到稳定表达mi R-150的细胞株,所建的方法可以应用于各种microRNA的构建。
- 代晨邓文张彦明
- 关键词：猪瘟病毒发夹RNA转染
- 猪血管内皮细胞中的microRNA及其在猪瘟病毒感染中的作用
- 本研究的目的是建立猪血管内皮细胞的miRNA库，以发现新的miRNA，并探讨miRNA对猪瘟病毒增殖的调节作用，为揭示猪瘟病毒的感染的机理提供科学资料。试验结果提示在机体内miRNA可能参与了猪瘟病毒的复制和感染过程。
- 张彦明郭抗抗张倩代晨邓文侯勃张旭唐青海
- 关键词：猪瘟病毒MICRORNA血管内皮细胞病毒增殖
- 表达猪白介素2基因重组腺病毒的构建及其免疫增强作用被引量：3
- 2010年
- 以猪白介素2基因(pIL-2)为研究对象构建表达pIL-2的重组腺病毒,并研究其作为细胞因子佐剂的免疫增强作用。用RT-PCR的方法扩增pIL-2基因,将pIL-2基因克隆到腺病毒穿梭载体AdTrack中,构建出重组腺病毒穿梭质粒AdTrack-pIL-2,然后在大肠杆菌BJ5183内和骨架载体AdEasy同源重组,获得重组腺病毒骨架载体AdEasy-pIL-2,转染HEK293细胞,包装出重组腺病毒Ad-pIL-2,并通过兔体交互试验来检测Ad-pIL-2的免疫增强作用。经PCR、RT-PCR和Western blot检测,成功构建了Ad-pIL-2,病毒滴度可以达到108.25pfu/mL,并通过兔体交互免疫试验证明Ad-pIL-2可以提高兔的抗体水平。用腺病毒构建的Ad-pIL-2在兔体上具有免疫增强作用,为下一步的猪体试验研究和细胞因子佐剂的开发奠定基础。
- 何雷张彦明向华唐青海徐彦召杨小云王静代晨
- 关键词：重组腺病毒细胞因子佐剂
- TGF-β_1基因真核表达载体的构建及在猪脐静脉内皮细胞中的表达被引量：4
- 2008年
- 应用RT-PCR技术从猪外周血单个核细胞扩增转化生长因子β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)全基因,构建含有TGF-β1基因及EGFP报告基因的真核表达质粒pEGFP-C1-TGF-β1。采用脂质体法转染体外培养的猪脐静脉内皮细胞(SUVECs)后,通过直接荧光观察pEGFP-C1-TGF-β1融合蛋白在细胞中的分布定位,并通过RT-PCR、间接免疫荧光方法检测TGF-β1基因在SUVECs中的表达。结果在转染后1周观察到绿色荧光,RT-PCR、间接免疫荧光法检测TGF-β1表达均为阳性。本研究成功构建了含有绿色荧光蛋白基因的真核表达载体pEGFP-C1-TGF-β1,且TGF-β1基因在SUVECs中获得表达。
- 王文秀邓文张彦明代晨熊奎州谢林红温元鹏
- 关键词：脐静脉内皮细胞转染
