国家海洋公益性行业科研专项(201105007)
- 作品数：7 被引量：30H指数：3
- 相关作者：常亚青王轶南封妮莎丁君宋坚更多>>
- 相关机构：大连海洋大学浙江万里学院上海海洋大学更多>>
- 发文基金：国家海洋公益性行业科研专项国家级星火计划辽宁省教育厅高等学校科学研究项目更多>>
- 相关领域：农业科学生物学更多>>
- 港口航道致病性细菌检测微阵列基因芯片的研制被引量：3
- 2017年
- 【目的】制备出一套针对港口航道致病性细菌检测的基因芯片,为港口航道基因芯片检测技术的研究及应用打下基础。【方法】采用常规方法提取目标菌株基因组DNA,以16S r DNA通用引物和gyr B基因保守区引物进行PCR扩增,使用Allele ID 6.0和Array Designer 4.25对扩增获得的目的片段进行寡核苷酸探针设计,经PCR筛选验证,目标探针以氨基化修饰后通过芯片点样仪点制在醛基玻片上;优化芯片杂交固定条件,并用于港口航道的水样检测,以验证微阵列基因芯片的检测效果。【结果】优化后的芯片杂交固定条件为探针点样浓度10μmol/L、紫外交联时间2.0 h、杂交温度65℃,有效提高了基因芯片检测的灵敏度,与传统检测方法相比可实现快速、高通量、准确的目标。研制的微阵列基因芯片可特异性检测出港口航道中含有的霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、阴沟肠杆菌(Emterobacter cloacae)、溶藻弧菌(V.alginolytivus)、哈氏弧菌(V.harveyi)、副溶血弧菌(V.parahemolyticus)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)和创伤弧菌(V.vulnificus)等7株致病性细菌,且均未出现非特异性杂交。【结论】针对港口航道致病性细菌建立的微阵列基因芯片检测技术具有特异性强、灵敏度高、快速便捷的特点,可用于港口航道及周边地区的海洋环境监测和海产品质量安全检测。
- 郭微微邱军强何培民管峰杨先乐
- 关键词：港口航道基因芯片
- 海水希瓦氏菌(Shewanella aquimarina)PCR检测方法被引量：1
- 2013年
- 海水希瓦氏菌(Shewanella aquimarina)是虾夷马粪海胆的一种致病菌。为建立海水希瓦氏菌PCR快速检测方法,根据海水希瓦氏菌gyrB基因的高变区序列设计3对引物,随后进行了其特异性和灵敏度分析。结果显示引物SA-9可扩增出片段大小为815 bp的海水希瓦氏菌特异片段。引物可检测的最低细菌量为4.6×103cfu/mL,最低DNA含量为3.15×10-4ng/μL。表明以SA-9为引物的PCR检测方法特异性强,灵敏度高。另外以该方法对海胆及其生境样品进行初步检测,发现健康海胆、养殖海水及投喂海带为阴性,而自然海域的海水具有一定量的海水希瓦氏菌。
- 王轶南穆晓虎封妮莎丁君常亚青
- 关键词：PCR特异性灵敏度
- 用16S rDNA克隆文库法分析患病刺参幼苗的菌群结构被引量：3
- 2014年
- 采用16S rDNA克隆文库法对某刺参养殖场患病刺参Apostichopus japonicus幼苗（体长为3～5 cm）表皮的菌群结构进行分析。结果表明：化皮参苗病灶组织和未明显化皮参苗表皮菌群均由γ-变形菌纲、β-变形菌纲和α-变形菌纲组成,优势菌为γ-变形菌纲,主要包括志贺氏菌Shigella sp.、不动杆菌Acinetobacter sp.和假单胞菌Pseudomonas sp.;化皮参苗病灶组织中志贺氏菌、不动杆菌和假单胞菌比例分别为49%、17%和5%,未明显化皮参苗表皮中3类菌的比例分别为20%、26%、9%。将该养殖场育苗池海水作为对照并进行菌群结构分析,结果显示,水中菌群同样由γ-变形菌纲、β-变形菌纲和α-变形菌纲组成,优势菌也为γ-变形菌纲,主要包含弧菌Vibrio sp.（75%）与志贺氏菌（12%）。此外,对化皮参苗病灶处进行细菌分离培养,得到一株优势菌,经16S rDNA初步鉴定为弧菌。研究表明,采用16S rDNA克隆文库法所得结果与传统的病原分离培养法存在差异。
- 王轶南王俊杰王姣姣刘志敏于卓丁君常亚青
- 关键词：刺参
- 不同时期刺参养殖池塘海水菌群结构分析被引量：5
- 2015年
- 对辽宁省大连市瓦房店刺参养殖池塘海水菌群结构组成和变化情况进行分析,采集不同时期刺参养殖池塘海水,扩增细菌16S r DNA基因V3可变区序列,进行变性梯度凝胶电泳（DGGE）,分析指纹图谱,并对主要条带进行切胶、回收和测序。结果表明,不同时期海水各样品的多样性指数在1.994 5~2.230 5之间,均匀度差异不大,样品的丰富度在42~48之间。不同时期海水中3月和9月的菌群结构最为相近（80%）,6月与其他各时期聚类距离最大。对39个主要条带的测序结果表明,12个条带与未培养细菌相近,1个条带与放线菌纲（Actinobacteridae）的菌株相似,另外26个条带相似菌株分别归类为黄杆菌纲（Flavobacteria）、α-变形菌纲（Alpha proteobacteria）、γ-变形菌纲（Gamma proteobacteria）。黄杆菌纲、α-变形菌纲和γ-变形菌纲在各时期海水中均有出现,其中黄杆菌纲优势度最高,占23.8%~50.0%。不同时期养殖池塘海水菌群的结构相对稳定,但具体菌种存在差异。
- 王姣姣李丹宋坚刘艳萍常亚青王轶南
- 关键词：刺参PCR-DGGE
- 虾夷马粪海胆致病菌强壮弧菌的PCR检测方法被引量：3
- 2012年
- 强壮弧菌Vibrio fortis是虾夷马粪海胆Strongylocentrotus intermedius的一种致病菌。为建立强壮弧菌的PCR检测方法,根据强壮弧菌gyrB基因的高度变异区序列设计引物,筛选出特异性强的3对引物VF-6、VF-7及VF-8,分别对强壮弧菌S0907及20株参比菌株进行PCR扩增,结果显示,3对引物均对强壮弧菌扩增出与预期大小一致的目的基因片段且参考菌株无扩增条带。以不同稀释度的菌悬液制备的DNA模板进行PCR扩增,结果显示,3对引物VF-6、VF-7及VF-8可检测的最低细菌浓度分别为4.1×104、4.1×103、4.1×102 cfu/mL;对不同稀释度的细菌DNA模板进行PCR扩增,结果显示,3对引物VF-6、VF-7及VF-8可检测的最低DNA含量分别为1.4、0.14、0.014 pg/μL。试验结果表明:3对引物的特异性均较好,但灵敏度存在差异,其中以VF-8为引物的PCR检测方法最佳;使用以VF-8为引物的PCR检测方法对实验室养殖海胆及其生境样品进行初步检测,健康海胆、养殖海水及投喂的海带均为阴性,而自然海域海水中带有一定量的强壮弧菌。
- 常亚青封妮莎王轶南丁君刘志敏穆小虎
- 关键词：虾夷马粪海胆PCR检测
- 食源性致病菌溯源分型技术研究进展被引量：7
- 2012年
- 1997年以来,欧盟为应对"疯牛病"问题逐步建立并完善食品安全管理制度,但是目前食品安全仍然是全世界最为关注并且积极寻求解决方案的重大议题之一,尤其是食源性致病菌引起的食品问题常年严重危害人类的生命健康和经济秩序。目前各国寻求各种技术解决食源性疾病问题,但由于微生物传染源难以监测控制,很多情况下需要针对发病人群进行后期的致病菌溯源,通过溯源可以总结经验,避免相似问题再次发生。细菌分型技术是食源性致病菌溯源技术的重要内容,包括表型分型和分子分型两种。常见的表型分型种类有血清学分型、噬菌体分型、耐药性分析等,分子分型类别有PFGE、16S rRNA序列分型、RFLP、基于测序方法的MLST等。
- 管峰杨季芳
- 关键词：致病菌食源性
- 仿刺参体腔液中酚氧化酶活性的分析被引量：9
- 2013年
- 在(22±1)℃下抽取体质量为95.0～105.0 g的仿刺参Apostichopus japonicas体腔液,制备体腔液及体腔细胞溶解上清液(CLS),分别测定其酚氧化酶(PO)活性,检测分析不同刺激物(CaCl2、MgCl2、LPS、SDS、Trypsin和甲醇)对酚氧化酶原(proPO)系统的激活效果,并比较了不同规格仿刺参体腔液的酚氧化酶活性。结果表明:仿刺参体腔液中的PO活性个体差异较大,平均为(146.90±55.60)U,体腔液与不同激活剂作用后PO活性均无明显变化;CLS中的PO活性为31.82 U,其在100 mmol/L MgCl2作用后PO活性大幅度提高,proPO比活为43.9 U,CLS与LPS、CaCl2和甲醇作用后PO活性无明显增加,与SDS和Trypsin作用后PO活性表现出一定的抑制。研究表明,仿刺参体腔液中的PO主要存在于体腔液中,CLS中的PO活性较低,proPO主要存在于体腔细胞中,可被Mg2+大幅度激活。52.4～68.5、20.7～24.4、4.9～5.6 g 3种规格的仿刺参体腔液中的PO活性分别为(42.18±7.62)、(34.10±9.28)、(33.29±7.42)U,表明不同规格仿刺参体腔液中的PO活性存在一定差异,总体呈现随规格的增大PO活性增强的趋势,其中100 g左右的仿刺参与3个较小规格的仿刺参体腔液中的PO活性存在显著性差异(P<0.05)。
- 王轶南穆晓虎封妮莎宋坚常亚青
- 关键词：仿刺参体腔液酚氧化酶酚氧化酶原
