广东省自然科学基金(8451012001001570)
- 作品数：5 被引量：13H指数：2
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- 表面表达幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白枯草芽孢的免疫原性被引量：1
- 2014年
- 目的 构建表面表达幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白（NAP）的重组枯草芽孢,并鉴定其免疫原性.方法 以构建的pGEX-4T-1-NAP质粒为模板,采用特异性引物扩增幽门螺杆菌NAP基因,与构建的以枯草芽孢外衣蛋白Cotc融合表达的质粒Pus186-Cotc连接,转化枯草杆菌WB600,提取质粒进行酶切、测序鉴定.应用营养耗竭法诱导枯草芽孢生成,提取重组芽孢外衣蛋白进行电泳及免疫印迹分析,并使用NAP特异性抗体免疫荧光检测芽孢表面重组蛋白的表达.以普通芽孢作为对照组,使用表面表达NAP的重组枯草芽孢口服免疫小鼠,ELISA法检测小鼠免疫后0、15、30、45 d的NAP特异性血清IgG水平,判断重组芽孢免疫原性.结果 以pGEX-4T-1-NAP质粒为模板,扩增了NAP基因,并成功克隆入Pus 186-Cotc质粒,重组Pus 186-Cotc-NAP双酶切鉴定可见435 bp目的片段,测序结果显示NAP在正确读框中.营养耗竭法可诱导重组枯草芽孢生成,产量达1×10^11/L,提取芽孢外衣蛋白电泳见相对分子质量25 600的目的条带.免疫印迹显示使用NAP特异性抗体在相应相对分子质量25 600可见识别带.并且使用NAP特异性抗体可检测到重组芽孢免疫荧光,表明NAP在芽孢表面成功表达.与对照组相比,NAP重组芽孢口服免疫小鼠15d后,NAP特异性IgG升高即达高峰,30、45 d后一直维持在高峰平台期（均P＜0.05）,表明重组芽孢具免疫原性.结论 成功构建了表面表达NAP的枯草芽孢工程菌,重组芽孢口服免疫小鼠具免疫原性,为幽门螺杆菌枯草芽孢疫苗的研制提供了依据.
- 周珍文姚淑雯关锐梨周帅谢永强陈吟霜钟华敏黄莲芬杨镒宇龚四堂
- 关键词：中性粒细胞激活蛋白免疫测定
- 幽门螺杆菌儿童分离株中性粒细胞激活蛋白克隆及表达序列被引量：1
- 2011年
- 目的:从幽门螺杆菌临床儿童分离株GZCH1基因组扩增中性粒细胞激活蛋白(NAP)基因,克隆入T载体,并亚克隆入表达载体pGEX-4T-1,进行测序及基因比对分析,为幽门螺杆菌疫苗研制奠定基础。方法:根据GenBank中幽门螺杆菌NAP序列,设计一对特异性引物扩增幽门螺杆菌临床儿童分离株NAP全长基因,与T载体连接,转化大肠杆菌DH5α,提取质粒进行酶切、测序鉴定,经EcoRⅠ、NotⅠ双酶切后与做相应酶切的pGEX-4T-1连接,转化大肠杆菌BL21,提取质粒进行双酶切鉴定,IPTG诱导重组蛋白表达,并对基因进行测序及比对分析。结果:以幽门螺杆菌儿童分离株GZCH1为模板,成功扩增了NAP基因,基因大小为435 bp,重组pGEX-4T-1-NAP双酶切鉴定可见目的片段,测序结果显示NAP在正确读框中,序列比对分析显示其与幽门螺杆菌J99株氨基酸一致性达99.2%,IPTG诱导后,pGEX-4T-1-NAP/BL21在相应分子量(42.8 kD)可见融合蛋白的表达。幽门螺杆菌儿童分离株GZCHl NAP序列已登录GenBank(登录号:GU301881)。结论:从幽门螺杆菌临床儿童分离株GZCH1中成功克隆了NAP基因,并获得重组蛋白的表达,为NAP幽门螺杆菌疫苗研制奠定了良好的基础。
- 周珍文关锐梨夏慧敏付捷邓秋连谢永强黄勇廖灿龚四堂
- 关键词：幽门螺杆菌儿童中性粒细胞激活蛋白克隆
- 幽门螺杆菌临床分离株尿素酶基因B的原核表达、纯化及免疫活性被引量：5
- 2010年
- 目的:在大肠杆菌中表达幽门螺杆菌临床分离株尿素酶B(UreB),纯化重组蛋白并分析其免疫活性。方法:将pGEX-4T-1-UreB重组菌BL21复舒,挑单菌落接种于含氨苄的LB培养基中,0.5mmoL异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组融合蛋白的表达,使用纯化的重组蛋白免疫小鼠,ELISA检测血清抗体效价,并使用感染患者血清进行Western-blotting鉴定重组蛋白反应原性。结果:SDS-PAGE示在约87kD相应分子量可见融合蛋白表达,产物主要在表达上清以可溶形式存在,纯化蛋白免疫小鼠能诱导产生特异性体液免疫应答,ELISA检测特异性IgG效价为1:51200,Westernblotting示重组蛋白能被幽门螺杆菌感染患者血清识别。结论:UreB在大肠杆菌中获得高效表达,表达产物具有较好的免疫原性及反应原性。
- 周珍文关锐梨夏慧敏邓秋连谢永强黄勇廖灿龚四堂
- 关键词：尿素酶B免疫活性
- 广州地区幽门螺杆菌儿童分离株空泡毒素基因A的分型被引量：1
- 2013年
- 目的探讨广州地区幽门螺杆菌(Hp)儿童分离株空泡毒素基因A(vacA)基因亚型的分布。方法从胃十二指肠疾病患儿胃黏膜标本中分离培养Hp,PCR法测定vacA的m1、m2、s1、s2基因亚型。结果从儿童胃黏膜标本中成功分离出106株Hp,106株中vacA基因m阳性率为94.34%(100/106),阴性率为5.66%(6/106)。m1阳性率为36.00%(36/100),m2阳性率为64.00%(64/100)。s阳性率为96.23%(102/106),阴性率为3.77%(4/106),基因分析显示均为s1。vacA亚型组合s1/m1阳性率为36.73%,s1/m2组合阳性率为63.27%。结论广州地区Hp儿童分离株vacA的优势基因型为vacAs1、vacAm2、vacAs1/m2。
- 姚淑雯关锐梨龚四堂黄敬杨镒宇谢永强邓秋连周帅周珍文
- 关键词：幽门螺杆菌聚合酶链反应
- 幽门螺杆菌儿童分离株尿素酶基因B的克隆及序列分析被引量：5
- 2009年
- 目的克隆幽门螺杆菌(Hp)临床儿童分离株尿素酶B(UreB)基因入pGEX-4T-1表达载体,并进行测序及基因比对分析,为以UreB作为Hp疫苗分子的口服疫苗研制奠定基础。方法根据GenBank中HpUreB序列,设计一对特异性引物PCR扩增Hp临床儿童分离株UreB全长基因,EcoRI及NotI酶切后与做相应酶切的pGEX-4T-1连接,转化大肠杆菌BL21,提取质粒进行双酶切鉴定及基因测序,并对测序结果进行比对分析。结果以Hp儿童分离株GZCH1为模板,成功扩增了UreB基因,基因大小为1710bp,重组pGEX-4T-1-Ure双酶切鉴定可见目的片段,测序结果显示UreB在正确阅读框中,序列比对分析显示其与相关报道序列核苷酸和氨基酸一致性达98%。Hp儿童分离株GZCH1UreB序列已登录GenBank(登录号:FJ455126)。结论从Hp儿童分离株GZCH1中成功克隆了UreB基因,为UreBHp口服疫苗研制奠定了基础。
- 周珍文邓秋连夏慧敏耿岚岚梁伟河谢永强黄勇龚四堂
- 关键词：幽门螺杆菌克隆儿童
