国家自然科学基金(31172342)
- 作品数：16 被引量：51H指数：5
- 相关作者：李刚金红岩隋修锟李文超梁琳更多>>
- 相关机构：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所西藏职业技术学院河北北方学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家公益性行业科研专项国家科技支撑计划更多>>
- 相关领域：农业科学生物学医药卫生更多>>
- 四株鸽Ⅰ型副黏病毒的分离鉴定及基因型分析被引量：3
- 2013年
- 为掌握安徽省鸽Ⅰ型副黏病毒病的流行特点及其与鸡新城疫各分离株的相互关系,对从安徽省不同鸽场鸽病料中分离的4株病毒(AH-2012、AH-2012-1、AH-2012-2、AH-2012-3),采用RT-PCR、血清学试验及基因序列测定等方法进行鉴定。结果显示,这些分离株均具有血凝性,并能使NDV标准阳性血清特异性抑制;PCR扩增出F基因特异性目的片段,其核苷酸序列与GenBank上登录的鸽Ⅰ型副黏病毒的同源性较高,相似性达94.8%;与传统的鸡源新城疫病毒标准株LaSota、F48E9的同源性较低,相似性约为80%;F基因编码蛋白的第112～117位氨基酸序列为R-R-Q-K-R-F。结果表明,这些毒株为鸽Ⅰ型副黏病毒,属于基因Ⅵ型。
- 隋修锟李刚李铁吴迪程朝飞陶春爱黄华欣
- 关键词：F基因
- 狂犬病病毒基质蛋白的原核表达及其间接ELISA方法的建立被引量：8
- 2013年
- 目的以原核表达的狂犬病病毒M蛋白作为检测抗原,建立间接ELISA方法用来检测狂犬病病毒抗体。方法为表达狂犬病病毒(RV)基质蛋白(M),采用RT-PCR方法从狂犬病病毒Flury-LEP株中扩增RV基质蛋白基因,双酶切后定向克隆至原核表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET-M。将重组质粒pET-M转化至宿主菌E.coli Rosetta中进行表达。SDS-PAGE和Western blot分析确定蛋白表达量和特异性。用纯化的重组M蛋白作为包被抗原建立检测犬RV抗体的间接ELISA方法,通过优化反应条件,确定抗原最佳包被量、血清的最佳稀释度、Protein A-HRP的最佳稀释度。结果经PCR、双酶切及测序鉴定,重组质粒pET-M构建成功,将重组质粒进行转化后诱导表达,经SDS-PAGE电泳分析得到高效表达的M蛋白,重组蛋白可被RV阳性血清特异性识别,表明基质蛋白具有良好的反应原性。用表达的狂犬病病毒M蛋白建立了检测RV抗体的间接ELISA方法,用该间接ELISA方法与以狂犬病病毒作为诊断抗原的商品化ELISA试剂盒分别对93份临床血清样品进行检测,结果两者的符合率为89.2%。结论用原核表达的重组M蛋白作为包被抗原建立的间接ELISA方法可用做检测犬RV抗体水平的参考。
- 宫苗苗曾妮程朝飞李刚
- 关键词：狂犬病病毒基质蛋白原核表达蛋白纯化酶联免疫吸附试验
- 实时荧光定量RT-PCR检测小反刍兽疫病毒方法的建立被引量：6
- 2016年
- 本试验旨在建立一种快速、灵敏的诊断小反刍兽疫的方法。本研究通过RT-PCR方法扩增小反刍兽疫病毒N基因,连接到pMD19-T克隆载体上,构建质粒标准品。根据GenBank中中国流行毒株及Nigeria 75/1疫苗株N基因保守序列设计引物,利用SYBR GreenⅠ法进行实时荧光定量PCR,建立标准曲线,并进行特异性试验、敏感性试验和重复性试验。结果表明,在2.82×100-2.82×10^7拷贝/μL范围内,Ct值与质粒拷贝数对数值呈良好的线性关系,标准曲线线性关系R2值为0.992;其他病毒无特异性扩增曲线,特异性良好;批内变异系数为0.27%-2.77%,批间变异系数为0.41%-3.39%,重复性较好;检测灵敏度可达2.82拷贝/μL,是普通PCR的1 000倍。用该方法对12份cDNA样品进行检测,9份为阳性,3份为阴性,而普通PCR检测,7份为阳性,5份为阴性,说明本方法比普通PCR灵敏度高。本检测方法的建立对快速、灵敏诊断小反刍兽疫,防止疫情的扩散具有重要意义。
- 赵玲娜金红岩梁琳李刚
- 关键词：小反刍兽疫病毒实时荧光定量RT-PCRSYBR
- TaqMan荧光定量PCR检测鸡产蛋下降综合征病毒方法的建立及应用被引量：3
- 2012年
- 根据GenBank公布的鸡产蛋下降综合征病毒六邻体蛋白基因的高度保守序列,设计了2对特异性引物和1条TaqMan探针。以构建的阳性重组质粒为标准品,绘制标准曲线,建立了一种快速检测鸡产蛋下降综合征病毒的TaqMan荧光实时定量PCR方法。该方法最小检出量达10copies.μL-1,在1.0×102～1.0×108copies.μL-1检测范围间有良好的线性关系,特异性、稳定性和重复性也较好。用建立的本方法检测感染鸡产蛋下降综合征病毒鸡群的产蛋分离物,与普通PCR相比,该荧光实时定量PCR方法具有更高的敏感性,可更好地用于鸡产蛋下降综合征病毒的临床检测。
- 马震原李刚李文超郭宇飞
- 关键词：TAQMAN探针荧光实时定量PCR
- 小反刍兽疫病毒H蛋白与SLAM受体相互作用的预测及初步鉴定
- 为了解小反刍兽疫病毒H蛋白与其SLAM受体相互作用的机制,进一步促进PPRV在感染、传播和致病机制的研究工作,本研究通过生物信息学技术对不同PPRV H蛋白和SLAM受体蛋白的胞外区、信号肽进行了预测.为进一步揭示PPR...
- 金红岩封家旺隋修馄李文超梁琳史利军赵占中薛晓娟赵玲娜Makay李刚
- 关键词：相互作用
- 小反刍兽疫病毒M蛋白主要抗原表位区的原核表达及鉴定被引量：8
- 2013年
- 为了制备小反刍兽疫病毒(PPRV)特异性单抗及临床抗体水平监测,通过在线软件分析PPRVNigeria75/1株M蛋白可能包含的B细胞线性表位位点,结合可溶性预测,设计1对引物,扩增303bp目的基因。将目的基因克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,用IPTG诱导表达,纯化,SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定结果显示,所构建的重组蛋白以可溶性形式高效表达并具有良好的反应原性,为制备特异性单抗及包被抗原用于PPRV抗体水平监测奠定了一定基础。
- 黄华欣李刚史利军赵占中王勇金红岩李文超陶春爱隋修锟
- 关键词：小反刍兽疫M蛋白抗原表位原核表达
- 间接ELISA和竞争ELISA检测小反刍兽疫病毒抗体的比较被引量：5
- 2014年
- 旨在比较检测小反刍兽疫抗体的间接ELISA和竞争ELISA方法,通过诱导表达小反刍兽疫病毒(PPRV)N蛋白,并以此作为包被抗原,检测94份绵羊和25份山羊血清样本。结果显示间接ELISA与标准竞争ELISA试剂盒的符合率为74.8%,竞争ELISA与标准竞争ELISA试剂盒的符合率为96.6%。竞争ELISA比间接ELISA方法检测结果可信度高,适于临床推广应用。
- 王净李刚史利军
- 关键词：小反刍兽疫病毒N蛋白间接ELISA竞争ELISA
- 小反刍兽疫病毒H基因DNA疫苗的构建及对小鼠的免疫原性
- 2014年
- 旨在构建表达小反刍兽疫病毒(PPRV)H蛋白的核酸疫苗,并评价其对小鼠的免疫原性。利用RT-PCR扩增了PPRV的H基因并将其克隆到pcDNA3.1(+)载体中,构建真核表达质粒pcDNA3.1-H,然后转染鸡胚成纤维(CEF)细胞,采用间接免疫荧光和Western blot检测H蛋白的瞬时表达情况。将重组质粒通过后腿肌肉注射的方式免疫BALB/c小鼠,采用间接ELISA、淋巴细胞增殖试验和细胞因子检测评价该DNA疫苗的免疫效果,结果表明,成功构建了重组真核表达质粒pcDNA3.1-H,并且能够在CEF细胞中表达。免疫小鼠后,pcDNA3.1-H能够诱导小鼠产生较高的特异性抗体水平,DNA疫苗免疫组小鼠的脾淋巴细胞增殖试验刺激指数(SI)均高于空载体和PBS免疫组,并且能够分泌较高水平的IFN-γ和IL-4。因此,制备的DNA疫苗免疫小鼠后可诱导体液免疫应答和细胞免疫应答,具有较好的应用前景。
- 李文超隋修锟金红岩梁琳王文泉李刚
- 关键词：小反刍兽疫病毒DNA疫苗H基因免疫原性
- 狂犬病病毒N、G两种蛋白在间接ELISA方法中的应用比较
- 2013年
- 目的比较狂犬病N、G两种蛋白检测抗体效果。方法本研究先通过比较pET-32a(+)和pGEX-6P-1两种载体表达的狂犬病病毒G蛋白和N蛋白,采用碳酸盐纯化表达量高的两种蛋白,再以纯化的抗原用于检测93份免疫犬血清。结果 (1)以pGEX-6P-1为载体的N、G两种蛋白表达量较高。(2)碳酸盐包被液可以得到纯度较高的蛋白。(3)间接ELISA检测93份抗体,其中56份G蛋白高于N蛋白,37份N蛋白高于G蛋白。(4)血清样本检测结果都为阳性,表明免疫效果良好。结论针对N、G两种蛋白的抗体在动物体内出现时间不同,哪种抗体出现的早,有待于我们进一步研究。
- 王净史利军李刚孙全文吴淑琴
- 关键词：N蛋白G蛋白蛋白纯化抗体检测
- 小反刍兽疫病毒受体细胞系的构建及应用被引量：2
- 2017年
- 为建立一株稳定表达山羊淋巴细胞活化分子(signaling lym phocyte activation molecule,SLA M)的细胞系,给研究小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)感染机制、病毒的分离和疫苗生产等奠定基础,本研究采用PCR扩增了SLAM基因,并将其胞外区连接至pD isplay载体,构建了重组质粒pDisplayg SLAM;利用p Display载体的G 418抗性及抗SLAM单克隆抗体,筛选表达gSLAM的Vero-E6细胞系,对该细胞系进行PCR鉴定、间接免疫荧光试验和Western-blot鉴定。采用该细胞系分离PPRV,并与Vero-E6细胞同时吸附PPRV分离株和疫苗株病毒后进行比较。结果,成功筛选出表达g SLAM的Vero-E6细胞系gSLAM/Vero-E6,并通过PCR方法成功扩增出gSLAM基因。通过间接免疫荧光试验和Western-blot鉴定,gSLAM基因成功表达在细胞膜上,并分离出一株PPRV。gSLAM/Vero-E6细胞系和Vero-E6细胞同时吸附PPRV分离株和疫苗株后,gSLAM/Vero-E6细胞系较Vero-E6细胞产生更明显的细胞病变。上述研究结果表明,gSLAM/Vero-E6细胞系对PPRV是高度敏感,为PPRV的后续研究提供了试验材料。
- 金红岩封家旺梁琳赵玲娜隋修锟史利军侯绍华李刚
- 关键词：小反刍兽疫病毒细胞系
