国家高技术研究发展计划(863-102-452)
- 作品数：1 被引量：18H指数：1
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- 发文基金：国家自然科学基金国家高技术研究发展计划更多>>
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- 细菌内同源重组法高效制备含CD、TK融合自杀基因重组体腺病毒被引量：18
- 2000年
- 目的 :采用细菌内同源重组法高效制备含CD、TK融合自杀基因重组体腺病毒。方法 :CD、TK融合基因CDglyTK自载体 pWZLneoCDglyTK中切出 ,亚克隆至腺病毒穿梭质粒中 ,形成转移质粒 pAdtrackCMV CDglyTK ,将之PmeI酶切线性化后与腺病毒基因组质粒 pAdeasy 1共转化BJ5 183菌 ,抽提重组体腺病毒基因组质粒DNA ,PacI酶切后转染 2 93细胞包装成腺病毒颗粒 ,采用PCR方法对重组体腺病毒进行鉴定 ,利用报告GFP基因对病毒滴度和感染效率进行测定 ,WesternBlot检测感染腺病毒的肿瘤细胞中有无目的基因的表达。结果 :由pAdTrack CMV CDglyTK和 pAdeasy 1共转化BJ5 183菌 16～ 2 0h后 ,可获得 30 %左右的阳性重组体细菌克隆 ,由重组体克隆质粒DNA转染 2 93细胞包装产生的重组体腺病毒 ,经PCR检测表明已含有目的基因 ,且无复制能力腺病毒的存在。纯化所得腺病毒滴度约为 8× 10 12 pfu/L ,当MOI =10 0时 ,腺病毒感染HepG1细胞的效率 >75 % ,WesternBlot证实在感染重组体腺病毒的细胞中有相应基因产物的表达。结论 :细菌内同源重组法是一种高效、简便、快捷的重组体腺病毒载体制备方法。所制备的Ad CDglyTK在体外能有效表达相应的基因产物 ,为今后的深入研究奠定了基础。
- 魏道严糜军陈诗书
- 关键词：肿瘤基因治疗腺病毒载体CDTK融合自杀基因
