河南省科技攻关计划(092102110162)
- 作品数：9 被引量：31H指数：2
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- 相关机构：河南科技大学中国农业科学院哈尔滨兽医研究所更多>>
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- 禽多杀性巴氏杆菌ompa基因在Vero细胞中的表达
- 2010年
- 利用PCR技术扩增出禽多杀性巴氏杆菌1 050 bp的ompa基因片段,克隆到pUCm-T载体上,再亚克隆到真核载体pcDNA3.1(+)上,构建重组质粒pCA(pcDNA3.1-OmpA),将该重组质粒体外转染Vero细胞,检测其转录和表达情况。结果表明重组质粒pCA构建成功,通过RT-PCR由转染了重组质粒的Vero细胞中扩增出了目的条带,间接免疫荧光试验分析表明在转染了pCA的Vero细胞中出现绿色荧光,Western blotting分析显示重组质粒pCA转染的Vero细胞泳道出现约37.5 ku的特异条带,说明ompa基因在Vero细胞中成功表达了活性蛋白,从而为进一步研究禽多杀性巴氏杆菌ompa DNA疫苗的免疫效果奠定了基础。
- 宫强牛明福秦翠丽张敏孙晓菲王帅涛程铭
- 关键词：禽多杀性巴氏杆菌间接免疫荧光试验
- 禽多杀性巴氏杆菌OmpA DNA疫苗免疫效果的研究被引量：3
- 2011年
- 目的：研究禽多杀性巴氏杆菌OmpA DNA疫苗在鸡体内诱导的免疫保护效果。方法：PCR扩增禽多杀性巴氏杆菌的ompa基因片段,克隆入pcDNA3.1（＋）上,构建重组质粒pOMPA,体外转染SP2/0细胞,RT-PCR和免疫荧光试验检测目的基因的转录及表达情况。动物免疫共分四组：pOMPA组、弱毒疫苗组、pCDNA3.1（＋）空载体组和PBS对照组,每组15只4周龄鸡,除弱毒疫苗组外其他三组均肌注免疫三次,每次间隔两周,弱毒疫苗组仅首免时肌注1羽份/每只鸡。间接ELISA检测免疫后血清特异性抗体水平,MTT法检测免疫鸡外周血淋巴细胞增殖情况,双抗夹心ELISA检测IFN~γ分泌情况,强毒攻击,计算免疫鸡存活数目及保护率。结果：体外转染检测结果表明pOMPA可在体外培养的细胞中表达目的蛋白。动物免疫后,DNA疫苗组和弱毒疫苗组血清抗体水平持续上升,与两对照组相比差异极显著（P〈0.01）,且弱毒疫苗组血清抗体水平明显高于DNA疫苗组（P〈0.05）。经提取的外膜蛋白（Omps）诱生后,两疫苗组的SI值极显著高于pCDNA3.1（＋）组和PBS免疫组（P〈0.01）,两疫苗组之间则无差别。两疫苗组免疫鸡外周血淋巴细胞产生的IFNγ-极显著高于两对照组（P〈0.01）。强毒攻击后DNA疫苗组和弱毒疫苗组的保护率分别为60%和73.3%。结论：成功构建了禽多杀性巴氏杆菌OmpA DNA疫苗,该疫苗为动物提供一定的免疫保护力,但不够理想。
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- 关键词：禽多杀性巴氏杆菌免疫应答
- 禽多杀性巴氏杆菌外膜蛋白H基因在真核细胞中的表达及检测
- 2010年
- 利用PCR技术扩增出禽多杀性巴氏杆菌1 050 bp的外膜蛋白H基因(omph)片段,克隆到pMD18-T上,再亚克隆到真核载体pcDNA3.1(+)上,构建重组质粒pOMPH,将该重组质粒体外转染SP2/0细胞,检测其表达情况。结果表明本试验成功构建了真核表达质粒pOMPH,通过RT-PCR由转染了重组质粒的SP2/0细胞中扩增出了目的条带,Western blotting分析结果显示重组质粒pOMPH转染的SP2/0细胞泳道出现38ku的特异条带,间接免疫荧光分析表明在转染了pOMPH的SP2/0细胞中出现绿色荧光,说明omph基因在SP2/0细胞中成功表达了活性蛋白,从而为进一步研制DNA疫苗奠定了基础。
- 宫强牛明福秦翠丽孙晓菲王帅涛曲宁
- 关键词：禽多杀性巴氏杆菌
- 禽多杀性巴氏杆菌外膜蛋白H基因重组质粒在鸡体内免疫效果的研究被引量：1
- 2012年
- 为检测禽多杀性巴氏杆菌(P.multocida)外膜蛋白H基因的免疫效果,本研究利用PCR技术扩增禽P.multocida的omph基因片段,并克隆于pcDNA3.1(+)中构建重组质粒pOMPH,经体外表达检测后进行动物免疫,实验动物共分4组:pOMPH组、弱毒疫苗组、pcDNA3.1(+)空载体组和PBS对照组。免疫后对各组鸡进行免疫指标检测,并于三免后两周进行攻毒。结果显示,pOMPH免疫组和弱毒疫苗免疫组血清抗体水平持续上升,与两对照组相比差异极显著(p<0.01),并且pOMPH免疫组血清抗体水平明显高于弱毒疫苗组(p<0.05)。淋巴细胞增殖试验结果也表明,pOMPH和弱毒疫苗组的刺激值(SI值)极显著高于两对照组(p<0.01),并且重组质粒组高于弱毒疫苗组。免疫鸡外周血淋巴细胞产生的IFN-γ极显著高于两对照组(p<0.01),并且pOMPH组高于弱毒疫苗组(p<0.05)。攻毒后pOMPH组和弱毒疫苗组的保护率分别为66.7%和73.3%,表明pOMPH虽然可以为免疫鸡提供一定的保护,但效果不如商品化的弱毒活疫苗,还需采取措施进一步增强其免疫原性。
- 宫强彭永刚秦翠丽牛明福张爱国
- 关键词：禽多杀性巴氏杆菌免疫效果
- 禽巴氏杆菌OmpH外膜蛋白DNA疫苗的免疫效果被引量：2
- 2010年
- 目的:研究禽多杀性巴氏杆菌omph DNA疫苗在小鼠体内诱导的免疫保护效果。方法:利用PCR技术扩增出禽多杀性巴氏杆菌的omph基因片段,克隆到pMD18-T上,再亚克隆到真核载体pcDNA3.1(+)上,构建重组质粒pOMPH,体外转染SP2/0细胞,RT-PCR、间接免疫荧光试验、Western blot检测其转录及表达情况。然后进行动物免疫,实验动物分为三组即:pOMPH组、pCDNA3.1(+)空载体组和PBS对照组,每组16只BALB/c小鼠,pOMPH组和pCDNA3.1(+)组以100μg/只的剂量肌注免疫,PBS组每只小鼠肌注100μl1×PBS,各组均进行了三次免疫,每次间隔两周。间接ELISA检测免疫后小鼠血清特异性抗体水平,MTT法检测免疫小鼠脾淋巴细胞增殖情况,三免两周后检测脾淋巴细胞IFN-γ分泌情况。强毒攻击,计算小鼠存活数目及保护率。结果:间接免疫荧光试验、Western blot和RT-PCR检测结果均表明pOMPH可在体外培养的SP2/0细胞中表达目的蛋白。动物免疫后,pOMPH组免疫小鼠血清抗体水平持续上升,与pCDNA3.1(+)组和PBS组相比差异极显著(P<0.01)。经提取的外膜蛋白(Omps)刺激后,pOMPH组的刺激值(SI值)与pCDNA3.1(+)组及PBS免疫组相比均差异显著(P<0.05)。免疫小鼠脾细胞产生的IFN-γ极显著高于两对照组产生的IFN-γ(P<0.01)。攻毒后pOMPH组保护率明显高于两对照组,可达70%。结论:成功构建了禽多杀性巴氏杆菌omph DNA疫苗,该疫苗可诱导免疫小鼠产生较强的体液和细胞免疫应答及较好的保护效果。
- 宫强牛明福王帅涛秦翠丽孙晓菲马丽苹侯玉泽
- 关键词：禽多杀性巴氏杆菌DNA疫苗免疫应答
- 禽多杀性巴氏杆菌外膜蛋白和脂多糖的免疫保护效果被引量：2
- 2011年
- 为确定禽多杀性巴氏杆菌(P.multocida)的保护性抗原外膜蛋白(OMPs)和脂多糖(LPS)在抵抗感染中的作用,本研究提取了禽P.multocida CVCC 474的OMPs和LPS成分,将该两种成分分别与弗氏佐剂混合制备免疫原,进行动物免疫。小鼠分为4组:OMPs组、LPS组、禽P.multocida弱毒活疫苗组和PBS对照组,每组16只。各组均免疫3次,每次间隔两周。间接ELISA检测免疫后小鼠血清特异性抗体水平,MTT法检测小鼠脾淋巴细胞增殖情况。以禽P.multocida强毒株CVCC 474进行攻毒,计算小鼠死亡数及保护率。实验结果表明,动物免疫后,OMPs组与LPS组免疫小鼠特异性血清抗体水平持续升高,与弱毒活疫苗组水平相近,与PBS组相比差异极显著(p<0.01)。脾淋巴细胞增殖试验表明,OMPs组、LPS组和弱毒活疫苗组的SI值极显著高于PBS对照组(p<0.01),但3个免疫组之间则无明显差异(p>0.05)。攻毒保护试验结果显示,OMPs免疫组的保护率与弱毒活疫苗相当,为8/10,高于LPS免疫组的保护率(7/10),表明OMPs作为研制禽P.multocida亚单位疫苗具有良好的应用前景。
- 王帅涛宫强彭永刚程茗秦翠丽张敏牛明福
- 关键词：禽多杀性巴氏杆菌外膜蛋白脂多糖疫苗免疫应答
- 禽多杀性巴氏杆菌外膜蛋白单价DNA疫苗及融合DNA疫苗的免疫效果分析被引量：2
- 2012年
- 为探讨禽多杀性巴氏杆菌omph和ompa基因单价DNA疫苗及融合DNA疫苗的免疫效果,利用PCR技术扩增了禽多杀性巴氏杆菌omph和ompa基因片段,并克隆入pcDNA3.1(+),构建了DNA疫苗pcDNA-OMPH(pOMPH)、pcDNA-OMPA(pOMPA)和pcDNA-OMPH/OMPA(pOMPHA),将其体外转染SP2/0细胞,用间接免疫荧光试验检测其表达情况。同时以弱毒活疫苗作为阳性对照,pcDNA3.1(+)和PBS作为阴性对照,分别免疫4周龄鸡,检测血清特异性抗体水平、外周血淋巴细胞增殖情况和IFN-γ分泌情况,经强毒攻击后计算各疫苗的保护率。结果显示,融合DNA疫苗组血清抗体水平与弱毒活疫苗相当,明显高于单价DNA疫苗(P<0.05);pOMPHA组的刺激值(SI值)和IFN-γ分泌水平显著高于其他各组(P<0.05),单价DNA疫苗组略高于弱毒活疫苗组;强毒攻击后各DNA疫苗均可为动物提供一定的保护力,其中融合DNA疫苗的保护率最高,可达86.7%,其次为弱毒活疫苗,为73.3%,而单价DNA疫苗则低于弱毒活疫苗,仅为60%和66.7%。结果表明,DNA疫苗尤其是融合DNA疫苗在预防禽多杀性巴氏杆菌病(禽霍乱)方面具有较好的应用前景。
- 宫强张爱国牛明福秦翠丽孙晓菲
- 关键词：多杀性巴氏杆菌
- 多杀性巴氏杆菌毒力因子、免疫原及重要基因研究进展被引量：23
- 2010年
- 多杀性巴氏杆菌可引起禽霍乱、猪萎缩性鼻炎等多种动物疫病,是重要的动物病原微生物之一。其基因组编码的多种产物在该菌的致病性及诱导免疫应答方面具有重要作用,已成为研究的热点。作者就国内外多杀性巴氏杆菌荚膜、外膜蛋白、脂多糖等毒力因子和免疫原及其相关基因的研究进展进行了简要概述。
- 王帅涛宫强秦翠丽
- 关键词：多杀性巴氏杆菌毒力因子基因
- 禽多杀性巴氏杆菌ompa DNA疫苗在小鼠体内免疫效果试验被引量：1
- 2011年
- 应用PCR技术扩增获得禽多杀性巴氏杆菌的ompa基因片段,克隆到pUCm-T载体,再亚克隆到真核表达质粒载体pCDNA3.1(+)上,构建重组质粒pcA,体外转染Vero细胞,RT-PCR和间接免疫荧光试验检测其转录表达情况。动物免疫分为3组:pCDNA3.1(+)组、PBS对照组和pcA组,每组16只BALB/c小鼠,pCDNA3.1(+)组和pcA组以100μg/只的剂量肌注免疫,PBS组每只小鼠肌注100μL 1×PBS,各组均免疫3次,每次间隔2周。间接ELISA检测免疫后小鼠血清特异性抗体水平,MTT法检测免疫小鼠脾淋巴细胞增殖情况,三免2周后检测脾淋巴细胞IFN-γ分泌情况。强毒攻击,计算小鼠存活数目及保护率。结果显示,间接免疫荧光试验和RT-PCR检测结果均表明pcA可在体外培养的Vero细胞中表达目的蛋白。动物免疫后,pcA组免疫小鼠血清抗体水平持续上升,与pCDNA3.1(+)组和PBS组相比差异极为显著(P<0.01)。经提取的禽多杀性巴氏杆菌总外膜蛋白(Omps)刺激后,pcA组的刺激值(SI值)与pCDNA3.1(+)组及PBS免疫组相比均差异显著(P<0.05)。脾细胞产生的IFN-γ极显著高于两对照组(P<0.01)。强毒攻击后pcA组保护率明显高于两对照组,可达60%。结果表明,成功构建了禽多杀性巴氏杆菌ompa DNA疫苗,该疫苗可诱导免疫小鼠产生较强的体液和细胞免疫应答及一定的保护效果。
- 牛明福宫强秦翠丽孙晓菲王帅涛程铭
- 关键词：禽多杀性巴氏杆菌DNA疫苗
