国家科技支撑计划(2014BAI01B01)
- 作品数：60 被引量：154H指数：6
- 相关作者：代解杰孙晓梅阮光萍潘兴华刘菊芬更多>>
- 相关机构：中国医学科学院北京协和医学院昆明医科大学成都军区昆明总医院更多>>
- 发文基金：国家科技支撑计划国家自然科学基金云南省科技计划项目更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 以主要流行EV71 VP1基因高度保守区为靶点的TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立被引量：4
- 2016年
- 在我国,肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)C4型是引起手足口病的主要流行基因型。为建立EV71C4型TaqMan荧光定量PCR检测方法,在C4型EV71VP1基因的高保守区,设计合成引物和TaqMan探针,将包含此目的区段的基因片段克隆到pcDNA3.1载体中,通过体外转录获得标准品,并以梯度稀释的标准品为模板建立工作曲线,进而在优化反应条件的基础上建立TaqMan荧光实时定量PCR检测方法。实验中,所设计引物、探针的高度保守性保证了C4型EV71的高效扩增。经反应条件优化,引物和探针的最佳工作浓度分别为300 nmol/L和200 nmol/L,在1×10~301×10~3拷贝数检测范围内具有良好的线性关系(R^2=1),灵敏度可达到10~2 copies/μL。通过对该方法进行检验发现,批间和组间重复实验的变异系数均小于0.5%,且该方法对柯萨奇A16(coxsackievirus A16,CA16)柯萨奇B1(coxsackievirus B1,CB1)人轮状病毒(human rotavirus,HRV)单纯疱疹病毒2型(herpes Simplex virus type 2,HSV-2)均无交叉反应,对6份EV71阳性样本检出率为100%。以上数据表明,文中建立的TaqMan荧光定量PCR方法可为我国主要流行C4型EV71感染的快速诊断及疾病监控提供有效途径。
- 胡晓星彭杰冯悦刘丽张阿梅夏雪山
- 关键词：肠道病毒71型VP1基因TAQMAN探针荧光定量PCR
- 骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化的研究进展被引量：1
- 2015年
- 由各种因素导致的重症肝病的终末治疗的最好手段一直是原位肝移植,但长期以来肝供体的缺乏和免疫排斥引起的一系列问题极大地限制了该手术的运用,同时,在肝脏相关药物的筛选中,原代肝细胞难于培养且易在培养过程中变异,而随着骨髓间充质干细胞研究的深入,越来越多的证据表明骨髓间充质干细胞具有向肝细胞分化的潜能。因此,骨髓间充质干细胞诱导分化而成的肝样细胞在再生医疗和药物筛选领域具有较好的运用前景,本文就间充质干细胞的分离培养及其生物学特性,肝样细胞的诱导培养条件,生物学特性及其运用前景加以综述。
- 李振宇陈玲霞尹博文代解杰
- 关键词：间充质干细胞诱导分化肝样细胞
- 鸡蛋白提取液诱导细胞后干细胞蛋白芯片分析
- 2015年
- 目的:分析鸡蛋白提取液与细胞共培养是否能升高干细胞蛋白的表达,使细胞向干细胞转化。方法:用四种细胞,做一个普通培养,一个50%鸡蛋白提取液共培养,培养3 d后,收集细胞,冻于-80℃,送公司做干细胞蛋白芯片检测。结果:C57-BMSC有3个蛋白发生了统计学意义的改变,TS-UC-MSC有1个蛋白发生了统计学意义的改变,293T有1个蛋白发生了统计学意义的改变,293T-GFP有1个蛋白发生了统计学意义的改变。结论:50%鸡蛋白提取液共培养细胞后,细胞发生了向干细胞转变的现象。
- 阮光萍姚翔刘菊芬王金祥李自安胡媛媛潘兴华
- 关键词：细胞诱导
- 缺血后适应调控树鼩脑缺血海马CA1区Akt(pS473)和Akt(pT308)过磷酸化的抗凋亡机制被引量：2
- 2016年
- 目的观察树鼩脑缺血海马神经元Akt(p S473)和Akt(p T308)磷酸化改变对CA1区细胞凋亡的影响,探讨缺血后适应(PC)抑制细胞凋亡的可能机制。方法用光化学诱导法诱导树鼩脑缺血并建立缺血PC模型;用免疫组织化学TACS原位凋亡检测试剂盒检测皮层及海马CA1区神经元凋亡数量,用免疫组织化学法检测Akt(p S473)和Akt(p T308)表达的空间分布,用ELISA法检测海马CA1区神经元Akt(p S473)和Akt(p T308)磷酸化水平;用电子显微镜观察其神经元超微结构改变。结果脑缺血后神经元皱缩,核消失以缺血24h为著。脑缺血后4 h、24 h及72 h皮层及海马CA1区神经元TUNEL阳性细胞数明显增加(P<0.01),海马CA1区神经元Akt(p S473)和Akt(p T308)的表达及磷酸化水平明显升高,以脑缺血4 h的改变最明显,分别为(152.3±3.5)units/mg、(130.8±2.6)units/mg和(149.5±4.7)units/mg和(42.35±2.49)units/mg、(19.23±1.41)units/mg和(23.38±1.32)units/mg(P<0.01)。缺血PC组神经元损伤明显减轻,皮层及海马CA1区TUNEL阳性细胞明显减少(P<0.01),且与海马神经元Akt(p T308)活化水平呈平行改变(P<0.05)。结论树鼩脑缺血海马CA1区细胞凋亡与Akt(p S473)和Akt(p T308)过磷酸化的信号机制有关,缺血PC抑制海马神经元Akt(p S473)和Akt(p T308)双磷酸化可能具有抗凋亡作用。
- 汤諹李树清
- 关键词：脑缺血AKT磷酸化树鼩
- 实验树鼩空肠弯曲菌、沙门氏菌和志贺菌多重荧光定量PCR方法的建立被引量：13
- 2017年
- 目的为实验树鼩微生物检测提供一种快速、简便、灵敏,并且特异性强的空肠弯曲菌、沙门氏菌和志贺菌多重荧光定量PCR检测方法。方法根据空肠弯曲菌的Hip O区域、沙门菌的in V区域和志贺菌的ipa H区域设计特异性引物和探针,并进行单病原定量PCR检测验证;后分析多重PCR的灵敏度和特异性,并使用该多重PCR方法检测实验树鼩样品。结果本研究的PCR要素可用于空肠弯曲菌、沙门氏菌及志贺菌等单种菌的实时荧光定量PCR扩增。多重定量PCR扩增出了空肠弯曲菌、沙门氏菌和志贺氏菌标准扩增曲线;该方法的灵敏度为1×103ng/μL;特异性检测未从其他参考菌株中检出阳性。结论该多重定量PCR方法在实验树鼩微生物检测中具有很好的应用和推广前景。
- 冯育芳王莎莎邢进付瑞巩薇岳秉飞
- 关键词：空肠弯曲菌沙门氏菌志贺菌
- 树鼩CD4蛋白多克隆抗体的制备及检测被引量：1
- 2016年
- 目的 原核表达、纯化树鼩CD4蛋白并制备多克隆抗体,检测树鼩体内的CD4蛋白.方法 克隆树鼩CD4基因并连接到表达载体,构建重组质粒pET30a（＋）-CD4和pGEX-5X-1-CD4,表达并纯化重组蛋白His-CD4和GST-CD4,用不同佐剂[弗氏佐剂、MF59和A1（OH）3]制备多抗,用Western blot法检测血清抗体特异性.结果 蛋白表达产物His-CD4和GST-CD4的相对分子质量分别约为53.5×103和70.0×103,纯化后蛋白浓度分别为600 μg/mL和1 mg/mL;三组佐剂均能诱导产生抗体,抗体几何平均滴度（Geometric Mean Titer,GMT）的比较结果为：弗氏佐剂组（GMT：97 420）＞Al（OH）3佐剂组（GMT：67 202）＞MF59佐剂组（GMT：55 128）;其中弗氏佐剂组显著高于原蛋白组（P＜0.001）;Al（OH）3组显著高于原蛋白组（P＜0.01）;而MF59组显著高于原蛋白组（P＜0.05）.结论 制备了特异性良好的小鼠抗血清,能够特异性地结合树鼩的CD4蛋白.为下一步本实验室制备CD4单克隆抗体、CD4蛋白分子的功能研究以及树鼩的病毒感染模型等免疫相关实验的进行提供了基础.
- 卢孔杰徐婧雯张雪梅吴忠香任芳芳马娜巩蔚严丽蔚朱文兵董少忠
- 关键词：树鼩纯化多克隆抗体
- 勃氏甜龙竹水对高血脂大鼠肝脏的病理学影响被引量：1
- 2016年
- 为从肝脏的病理组织学改变的角度研究甜龙竹水对高血脂大鼠肝脏病理变化的影响,用高脂饲料饲喂清洁级雄性SD大鼠,建立高血脂大鼠模型,分别在建模过程中和饲喂8周成功建模后,饲喂甜龙竹水和立普妥,预防和治疗高血脂的发生,并设立空白对照组.取各组大鼠肝脏,制作冰冻切片及石蜡切片,进行油红O、HE和Masson染色,光镜下检查肝脏的脂肪变性分度、炎症分级、纤维化分期.结果显示:竹水预防高血脂组,比建模成功后饲喂竹水治疗组的肝脏脂肪变性程度明显减轻,表明甜龙竹水对高血脂相关肝脏病变的发生有预防作用;同时,竹水治疗组比对照模型组的肝脏病变更轻,表明甜龙竹水对高血脂肝脏病变发生后有一定的治疗作用.本研究发现为甜龙竹水作为保健功能食品的开发提供了科学依据.
- 罗丽琳徐永敏钟禄彪王晚璞陈天星杨龙夏雪山
- 关键词：非酒精性脂肪性肝病肝脏病理组织学
- 树鼩角膜内皮细胞体外原代培养方法的建立
- 目的建立树鼩角膜内皮细胞(corneal endothelial cells,CECs)体外分离、培养及纯化的稳定技术,为人类眼科角膜疾病提供新的实验材料。方法通过比较揭膜法、双酶消化法及揭膜-消化两步法,确定每种树鼩原...
- 苗雨润宋庆凯陈玲霞尹博文李晓飞代解杰
- 关键词：树鼩角膜内皮细胞体外原代培养
- 4-苯基咪唑+氢氧化铝复合佐剂对甲型肝炎减毒活疫苗诱导小鼠体液免疫应答的影响被引量：1
- 2017年
- 目的研究4-苯基咪唑(4-PI)+氢氧化铝[Al(OH)_3]复合佐剂对甲型肝炎减毒活疫苗(HepA-1)诱导的小鼠体液免疫应答的影响。方法实验设置7个分组,分别是:阴性对照组(1×PBS),铝佐剂组[HepA-1+Al(OH)_3],疫苗组(HepA-1),M1[HepA-1+Al(OH)_3+4-PI500μg]组,M2[HepA-1+Al(OH)_3+4-PI 1 mg]组,M3[HepA-1+Al(OH)_3+4-PI 1.5 mg]组和M4(HepA-1+4-PI 1mg)组,200μL HepA-1,24μL Al(OH)_3,随机分配小鼠,7只/组,分别皮下注射300μL,接种一次。用间接酶联免疫吸附法测试抗-甲型肝炎病毒(HAV)IgG抗体滴度,检测时间为免疫后4周、8周、12周、16周。实验过程中,观察和记录小鼠的健康情况。结果除阴性对照组,其余各组4个时间点均检测到抗-HAV IgG抗体,12周达到峰值。M2组在整个检测阶段抗体水平最高,显著高于疫苗组(t=4.449、3.633、2.565、6.809,P<0.05)和M4组(t=6.256、4.796、4.153、4.113,P<0.05),且第4周高于铝佐组(t=-2.877,P<0.05);M4组在4个时间点检测到的抗体水平与疫苗组相当。4-PI最佳剂量组是1 mg/只。实验全程观察到小鼠每项生理指标均正常。结论 4-PI+氢氧化铝复合佐剂能增强HepA-1诱导的小鼠体液免疫应答,有望开发成HepA-1新型复合佐剂。
- 马静王海漩李思瑾何慧胡凝珠胡云章
- 关键词：氢氧化铝体液免疫
- 滇西亚种树鼩微卫星分子标记的筛选被引量：5
- 2015年
- 目的筛选出适用于滇西亚种树鼩种群遗传质量控制的特异性微卫星分子标记。方法首先从树鼩全基因组序列中筛选出约700个微卫星位点,择优选出约100个位点设计引物,去除有不良因素的,最后保留33对和文献报道的13对引物对滇西亚种树鼩DNA进行PCR扩增,根据琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺电泳结果筛选保留,进行STR扫描再次筛选适于树鼩遗传检测的微卫星位点组合。结果筛选出树鼩微卫星位点22个,STR基因扫描有明显Stutter峰。比较备选位点和最终筛选出的位点,普通树鼩位点中选取5个,2个可用,与滇西亚种的重合率是40%;印度小树鼩位点中选取5个,2个可用,重合率是40%;中缅树鼩的位点中选取3个,2个可用,重合率约70%。结论筛选出的22个微卫星位点适用于滇西亚种树鼩的遗传检测,为树鼩种群的遗传质量监测提供科学依据。
- 张媛李晓飞李振宇仝品芬陈玲霞尹博文代解杰
- 关键词：微卫星分子标记
