国家自然科学基金(30400078)
- 作品数：7 被引量：23H指数：3
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- 腺病毒介导的RNA干涉对乳腺癌SKBR3细胞HER2的下调及生长抑制效应被引量：3
- 2007年
- 目的:探讨采用腺病毒做为载体介导基于RNA干涉的针对高HER2肿瘤的基因治疗的可能性。方法:构建HER2-绿色荧光蛋白融合蛋白表达质粒pHER2-GFP,并与9种针对HER2不同靶序列的siRNA表达质粒分别共转染CHO-K1细胞,根据荧光蛋白表达量从中筛选出沉默效率最高的质粒。将筛选出的质粒转染HER2高表达乳腺癌SKBR3细胞,检测它们对HER2表达的影响。随后,将siRNA转录单元克隆入腺病毒载体,成功包装病毒后感染SKBR3细胞,再次测定其下调HER2的效应及其对细胞生长的影响。结果:2种有效下调HER2表达的质粒被筛选出来。将此2种质粒所含siRNA转录单元包装入腺病毒后仍然保持了原有的基因沉默效应。HER2下调增加了SKBR3细胞中G1期细胞的比例,并且诱导部分细胞凋亡。MTT和细胞长期增殖抑制实验表明腺病毒介导的RNA干涉抑制了SKBR3细胞生长。结论:重组腺病毒介导的RNA干涉能够下调HER2的表达并且对高表达HER2的乳腺癌细胞有生长抑制作用。
- 程联胜查昭席甲甲江冰刘兢姚雪彪
- 关键词：RNA干涉小干涉RNA腺病毒基因治疗
- 慢病毒介导的RNA干涉对乳腺癌SKBR3细胞HER2受体的下调及生长抑制被引量：8
- 2007年
- 大约30%的乳腺癌中有表皮生长因子受体家族蛋白HER2的过表达,HER2表达水平与病人的预后以及恶性程度密切相关。RNA干涉(RNAi)是最近发展起来能特异性抑制哺乳动物细胞中基因表达的新技术。在以往鉴定的对HER2有良好RNAi效应的靶序列的基础上,构建了一系列U6和H1双启动子小干涉RNA(siRNA)表达载体,并转染HER2高表达乳腺癌SKBR3细胞定量测定了其HER2下调效应。随后,siRNA表达盒经LR重组反应被克隆入慢病毒载体中并成功包装成病毒。病毒感染SKBR3后经荧光定量PCR、蛋白印迹杂交和流式细胞仪一系列实验证明:慢病毒介导的RNAi确实能有效地下调肿瘤抗原HER2的表达,而且经慢病毒处理后细胞生长受到了抑制。为进一步阐明HER2与癌症恶化的关系以及发展新的基因治疗药物提供了新的工具。
- 程联胜查昭席甲甲江冰刘兢姚雪彪
- 关键词：RNA干涉小干涉RNA慢病毒基因治疗
- 细胞动粒蛋白Hec1启动子的结构及功能分析
- 2006年
- 细胞的分裂是一个严格调控,高度有序的过程.为了将复制后的染色体均匀、准确地传递给两个子细胞,细胞在分裂中后期受到纺锤体检验点的严格监控.Hec1定位于动粒,是纺锤体检验点调控的关键蛋白之一,它通过螺旋-螺旋结构域与其他动粒蛋白相互作用调节姐妹染色体的精确分离.为研究Hec1转录水平的调控机理,采用BLAST工具,从GenBank中搜索到了人Hec1基因上游的序列,并利用在线工具http://mbs.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html提供的转录因子结合位点搜索引擎,对其5′启动子调节区段进行了分析.分析结果表明:在Hec1基因上游-200～-1序列内,存在E2F、ATF4和cAMP应答元件结合蛋白(CREB)等转录因子调控元件.在结构分析的基础上,提取HeLa细胞基因组DNA,用PCR方法克隆了Hec1基因启动子,并构建了多个含启动子不同区段的pGL3荧光素酶报告基因表达质粒.瞬时转染HeLa细胞后的结果表明,-70～-63以及-155～-144之间的启动子区对维持荧光素酶活性最为关键.凝胶迁移实验证明,这两个区段分别能够和转录因子CREB以及ATF4结合.随后,采用野生型的以及含有133位磷酸化位点突变的CREB转染HeLa细胞,通过荧光定量PCR实验发现,Hec1的表达水平分别出现明显上升和下降.该结果表明,Hec1表达的调控是通过CREB的活化来完成的.
- 李良维刘兢姚雪彪程联胜
- 关键词：动粒启动子
- 基因工程抗体联合紫杉醇对BT474细胞的促凋亡作用
- 2007年
- 目的:探讨抗p185c-erbB-2/neu基因工程抗体联合紫杉醇促进p185过表达的人乳腺癌细胞系BT474凋亡的效应及其机制。方法:采用MTS法检测基因工程抗体联合紫杉醇对BT474细胞增殖的抑制作用。用AnnexinV-FITC/PI法检测BT474细胞的凋亡率;以流式细胞术(FCM)分析DNA含量及细胞周期分布;用EMSA分析NF-κB的活化水平。结果:基因工程抗体联合紫杉醇对BT474细胞增殖的抑制作用具有协同效应,并可诱导细胞凋亡,将细胞阻滞在G1期;并可显著抑制BT474细胞中NF-κB的活化。结论:紫杉醇诱导乳腺癌细胞BT474凋亡的同时,可活化NF-κB。基因工程抗体联合紫杉醇是通过抑制NF-κB的活化而增强紫杉醇诱导癌细胞凋亡的作用。
- 尹荟菁程联胜段家龙
- 关键词：基因工程抗体紫杉醇凋亡NF-ΚB乳腺癌
- 基因工程抗体增强紫杉醇诱导乳腺癌细胞SKBr3凋亡的作用被引量：2
- 2007年
- 目的探讨抗p185c-erbB-2/neu基因工程抗体增强化疗药物紫杉醇诱导p185高表达的人恶性乳腺癌细胞系SKBr3凋亡的效应及其机制。方法采用MTS法检测基因工程抗体、紫杉醇及两者联合对SKBr3细胞增殖的抑制作用;用AnnexinV-FITC/PI法和流式细胞术定量分析SKBr3细胞的凋亡率;用Western blot技术分别检测AKt的Ser473位点、NF-κBp65亚基的磷酸化水平;用EMSA分析SKBr3细胞核内NF-κB与DNA的结合活性。结果基因工程抗体可增强紫杉醇对SKBr3细胞增殖的抑制作用,并可诱导细胞凋亡;基因工程抗体联合紫杉醇并可显著抑制SKBr3细胞中AKt/NF-κB途径。结论紫杉醇诱导乳腺癌细胞SKBr3凋亡的同时,可能通过激活AKt/NF-κB途径使癌细胞对紫杉醇产生耐药性。抗p185c-erbB-2/neu基因工程抗体联合紫杉醇是通过抑制AKt/NF-κB途径而增强紫杉醇诱导癌细胞凋亡的作用。
- 尹荟菁程联胜
- 关键词：紫杉醇凋亡
- 富含二硫键的膜蛋白p185胞外区在大肠杆菌中的可溶性表达和性质鉴定被引量：7
- 2005年
- Her2/c_erbB_2基因(其产物为膜蛋白p185)是表皮生长因子受体(EGFR)基因家族的一员,在约30%的乳腺癌中发现了其过量表达。为了鉴定抗p185单克隆抗体的抗原表位并进一步研究它们的相互作用,采用PCR的方法从含Her2/c_erbB_2基因的pBabe/erbB_2质粒中扩增了p185胞外区的富含二硫键的第一、二结构域和第四个结构域。产物克隆到pGEX/4T_1载体后,转化大肠杆菌OrigamiB(DE3)pLysS菌株,用低浓度IPTG进行低温过夜诱导后将菌体压力破碎,SDS_PAGE检测表达上清,得到了可溶性表达的融合有GST的目的蛋白。经ELISA、Westernblot等方法鉴定,可溶性表达产物具有完全的抗体结合活性,且当用凝血酶把GST切掉后该活性仍然保留。p185胞外区融合蛋白的成功表达将为二硫键富含类蛋白的表达提供参考;并为将来具有肿瘤细胞生长抑制活性的抗p185单克隆抗体的抗原表位鉴定,以及为EGFR家族受体的结构和功能关系的研究打下基础。
- 李良维刘海波胡思怡梁顿程联胜刘兢
- 关键词：融合蛋白谷胱甘肽S转移酶
- 蛇毒C型凝集素类似蛋白Agkisacutacin单克隆抗体的制备和鉴定被引量：3
- 2007年
- 目的:制备并鉴定抗蛇毒C型凝聚素类蛋白Agkisacutacin的单克隆抗体(mAb)。方法:以Agkisacutacin蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,通过常规的细胞融合方法制备抗Agkisacutacin蛋白的mAb。用间接ELISA法检测杂交瘤细胞分泌mAb的稳定性。用荧光染色法做杂交瘤细胞的核型分析。用Western blot检测mAb的特异性。结果:获得3株可稳定分泌抗AgkisacutacinmAb的杂交瘤细胞株。结论:成功制备了抗Agkisacutacin的mAb,为检测Agkisacutacin蛋白作为新型抗血栓药物的体内代谢规律的方法和研究抗血栓的机制提供了重要的工具。
- 苏丽静肖亮战涛陈澜董艳秋方丽程联胜刘兢
- 关键词：单克隆抗体
