上海市浦江人才计划项目(09PJ1411900)
- 作品数：8 被引量：45H指数：4
- 相关作者：李泽君滕巧泱张树梅徐大伟张旭更多>>
- 相关机构：中国农业科学院上海兽医研究所内蒙古农业大学东北农业大学更多>>
- 发文基金：上海市浦江人才计划项目转基因生物新品种培育专项国家公益性行业科研专项更多>>
- 相关领域：农业科学生物学更多>>
- 表达3个外源基因真核表达载体的构建被引量：5
- 2011年
- 为构建可以同时表达3个外源基因的真核表达载体,本实验以pCAGGs载体为骨架,引入SV40启动子及单疱疹病毒(HSV)TK基因的polyA序列,并且在β-actin启动子下游插入内部核糖体进入位点序列(IRES),构建了能够同时表达3个外源基因的真核表达质粒pCAGGs-IRES。本研究将PR8流感病毒的M基因、绿色荧光蛋白基因EGFP及H1N1猪流感病毒的HA基因,分别克隆于pCAGGs-IRES载体的3个启动子下游,转染细胞后,通过间接免疫荧光和western blot表明本实验构建的pCAGGs-IRES载体能同时表达3个外源基因。该载体有望为基因疫苗、基因操作及蛋白质相互作用等研究提供新的真核表达载体。
- 张树梅黄海碧滕巧泱闫丽萍颜丕熙徐大伟戴晓光张旭呼和巴特尔李泽君
- 关键词：基因表达
- 稳定表达甲型流感病毒M1蛋白的MDCK细胞系的建立
- 2011年
- 为建立稳定表达流感病毒A/Puerto Rico/8/34(PR8)株M1蛋白的MDCK细胞系,将流感病毒PR8株M基因28～1 009bp序列插入逆转录病毒载体pMX,构建了重组质粒pMX-PR8M,并与pCI-NF-KB、pMDSV和MDSV质粒共转染293T细胞,制备逆转录病毒样颗粒。利用逆转录病毒样颗粒感染MD-CK细胞,经嘌呤霉素筛选获得具有抗性的细胞克隆,通过PCR、RT-PCR和间接免疫荧光试验筛选的鉴定方法。获得1株稳定表达M1蛋白的MDCK细胞系,命名为MDCK-PR8M1。本研究建立的表达M1蛋白的细胞系,为研究流感病毒M1蛋白生物学功能以及扩增含有外源基因的流感病毒提供了有利的工具。
- 张旭滕巧泱周洁文徐大伟颜丕熙姬希文闫丽萍戴晓光张树梅王洪斌李泽君
- 关键词：甲型流感病毒MDCK
- 稳定表达流感病毒PR8 HA蛋白MDCK细胞系的建立及鉴定被引量：3
- 2010年
- 为建立稳定表达流感病毒(IV)HA蛋白的MDCK细胞系,本研究利用含有嘌呤霉素抗性基因的pMX载体,在启动子下游的AgeⅠ和NotⅠ两个限制性内切酶位点之间插入PR8株HA基因的开放阅读框,构建重组质粒pMX-PR8HA,将pMX-PR8 HA与3个分别表达VSVG、gag/pol和NF-KB的重组质粒共转染293T细胞,获得逆转录病毒样颗粒。用含有逆转录病毒样颗粒的细胞培养上清液感染MDCK细胞,利用嘌呤霉素进行筛选、纯化得到稳定表达PR8株HA蛋白的细胞系。连续传10代后,进行PCR、RT-PCR、IFA和western blot鉴定,结果表明,获得了能够稳定表达IV PR8株HA蛋白的MDCK细胞系。该细胞系的建立有望为IV表达外源基因提供可靠的培养细胞系。
- 黄海碧滕巧泱王朝霞戴晓光张树梅张旭申之义李泽君
- 关键词：流感病毒HA基因
- 鸭坦布苏病毒病病原的分离鉴定及生物学特性研究被引量：24
- 2011年
- 2010年4月以来,上海、浙江和江苏等地的鸭场鸭群出现以高热、食欲废绝、产蛋下降为主要症状的疫病,病理变化表现为蛋鸭出现卵巢发生出血、萎缩、破裂,肉鸭脾脏明显肿大,肝脏有针尖状白色坏死灶。
- 李泽君
- 关键词：生物学特性鸭群病毒病病原产蛋下降病理变化
- 影响A型流感病毒样颗粒包装及释放的关键结构蛋白研究被引量：5
- 2011年
- 【目的】流感病毒样颗粒在病毒学研究和新型疫苗开发方面发挥着巨大作用。本研究旨在建立一种简便的包装病毒样颗粒的方法来阐明影响流感病毒样颗粒包装及释放的关键结构蛋白。【方法】构建同时表达HA、NA和M1 3个蛋白,同时表达HA和NA两个蛋白以及只表达HA蛋白的真核表达质粒,然后转染293 T细胞,检测细胞培养上清血凝效价初步判断是否包装并释放出病毒样颗粒,并采用透射电子显微镜观察病毒样颗粒的形态。【结果】表达HA和NA或表达HA、NA和M1蛋白的真核表达质粒转染293 T细胞后,检测细胞上清血凝价均为24;而转染单独表达HA蛋白质粒的细胞上清没有血凝活性。电镜观察表明单独表达HA蛋白没有可见的病毒样颗粒,而表达上述两个或3个蛋白均可观察到病毒样颗粒。【结论】本研究采用同时表达多个结构蛋白的真核表达载体来研究病毒样颗粒包装及释放的必须蛋白,研究结果表明M1在病毒样颗粒包装及释放过程中是非必须蛋白,而NA和HA蛋白是影响流感病毒样颗粒形成及释放的关键蛋白。
- 张树梅黄海碧颜丕熙滕巧泱闫丽萍徐大伟呼和巴特尔李泽君
- 关键词：HANA
- 稳定表达流感病毒PR8株NS1蛋白MDCK细胞系的建立
- 2011年
- 根据流感病毒A/Puerto Rico/8/34株NS1基因的核苷酸序列设计引物,PCR扩增后,将NS1完整开放阅读框分别克隆于pMX载体和PET30a载体,成功构建了pMX-PR8-NS1和PET-PR8-NS1重组质粒。将PET-PR8-NS1重组质粒转化Jm109感受态大肠杆菌,诱导表达获得重组NS1蛋白免疫小鼠制备多抗血清。同时,将逆转录病毒载体系统pMX-PR8-NS1、pCI-NF-KB、PMDSV和MDSV共转染293T细胞,制备逆转录病毒样粒子。将逆转录病毒样粒子感染MDCK细胞,利用嘌呤霉素进行抗性筛选。然后经过PCR、RT-PCR、间接免疫荧光鉴定,获得稳定表达PR8病毒NS1蛋白的细胞系,将之命名为MDCK-PR8-NS1细胞系。该细胞系的建立有望为深入开展流感病毒NS蛋白生物学功能的研究以及为扩增NS1基因删除的流感病毒提供了有利的工具。
- 张旭滕巧泱闫丽萍周洁文徐大伟颜丕熙姬希文戴晓光王洪斌高利李泽君
- 关键词：流感病毒NS1基因MDCK
- H9亚型禽流感病毒基质蛋白M1单克隆抗体的制备与鉴定被引量：6
- 2010年
- 本研究用纯化的H9N2亚型禽流感病毒免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合。对杂交瘤细胞及时筛选,阳性孔经3次有限稀释法克隆,成功获得3株能稳定传代并分泌抗H9亚型禽流感病毒基质蛋白M1单克隆抗体的杂交瘤细胞:3G8、2F6、5F2。间接ELISA方法检测,3株单克隆抗体的腹水间接ELISA效价达106以上。构建了真核表达载体pCAGGS-M1并转染于MDCK细胞,以用于腹水的Western blot和间接免疫荧光鉴定。间接免疫荧光结果表明,3株单克隆抗体皆与真核表达蛋白M1反应。这些单克隆抗体的制备为后期研究M1蛋白在流感病毒复制与出芽过程中的重要生物学功能奠定了基础。
- 戴晓光滕巧泱黄海碧王朝霞张树梅张旭徐大伟申之义李泽君
- 关键词：H9亚型禽流感病毒单克隆抗体间接免疫荧光蛋白免疫印迹法
- PR8流感病毒突变株的制备及其在鸡胚上生长特性的研究被引量：2
- 2010年
- 在前期发现流感病毒WSN株的NS2或NP蛋白突变使病毒在细胞上增殖能力明显提高的基础上,研究了这些突变是否会使PR8病毒效价在鸡胚上进一步提高的可行性,通过反向遗传操作技术获得了NS2E67S和NPP277A两株PR8突变病毒。经过比较突变病毒与野生病毒在鸡胚中的增殖能力,发现NS2E67S突变病毒在鸡胚上增殖后的效价与HA抗原表达量均明显提高,而NPP277A突变病毒在鸡胚上的增殖能力不及野生PR8病毒。该研究结果将对进一步研究病毒基因变异与宿主互作机制奠定基础,有可能通过NS2E67S突变病毒对改良流感疫苗具有重要的应用价值。
- 王朝霞滕巧泱戴晓光黄海碧张树梅张旭徐大伟李培锋李泽君
- 关键词：流感病毒突变株
