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猪卵透明带-3β蛋白核心片断在E.coli中的表达被引量：2: 2005年; 目的:探讨通过基因工程的方法在大肠杆菌中表达猪卵透明带蛋白pZP3b的核心片断。方法:采用PCR方法扩增原cDNA中编码第44-306个氨基酸的pZP3β核心片断的DNA序列,克隆入pET-3c载体进而在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)pLysS中表达。结果:表达的pZP3β核心蛋白占菌体总蛋白的15%,并经Western-blot鉴定为目的蛋白。结论:pZP3β核心片断在大肠杆菌中获得较高的表达,有利于产物的纯化,为后续阐明pZP3β核心区域的性质和相关抗生育研究打下了基础。; 谢秋玲陈小佳朱伟杰张玲徐万祥洪岸李菁高丝红; 关键词：大肠杆菌

基因重组大肠杆菌表达截短型pZP3β的发酵条件优化被引量：1: 2006年; 目的:对已构建好的表达pZP3β蛋白(pZP130)工程菌的培养条件进行优化,通过在5L罐中发酵和Ni柱纯化,以期获取较大量目的产物。方法:在摇瓶中改变不同的培养及诱导条件,比较工程菌的生长和目的蛋白的表达,优化发酵条件;并在5L发酵罐中进行发酵,获得菌体,破碎后进行Ni柱纯化。结果:优化的发酵条件是:10%的接种量,加入2%甘油的培养基培养菌体3h后加入0.5mmol/LIPTG,诱导4h后收样。在5L发酵罐中发酵,获得菌体量36g/L,经Ni柱纯化,获得蛋白粗制品33mg/L发酵液。结论:截短型pZP3β蛋白可以在E.coli中获得较高表达,并且可以通过发酵和Ni柱纯化得到较大量的蛋白,这有助于pZP的深入研究和应用。; 谢秋玲陈小佳朱伟杰赵振云吴建虹徐万祥刘侃李菁; 关键词：截短型发酵

翻译起始区突变对猪卵透明带-3β蛋白在E.coli表达的影响被引量：1: 2005年; 目的:探讨翻译起始区(translation initiation region,TIR)突变对两种氨基酸序列长度不同的猪卵透明带蛋白pZP3β161和pZP3β263在大肠杆菌中表达的影响。方法:应用DNASIS软件辅助分析,分别设计5条不同的上游引物对两种pZP3β基因的TIR区的G+C含量和自由能进行合理调整,PCR扩增后将获得的基因片段克隆入pET-3c载体,于大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中诱导表达。结果:TIR对pZP3β表达有明显的影响,其表达的pZP3β161蛋白和pZP3β263蛋白分别占菌总蛋白的25％和15％。结论:在不改变氨基酸的条件下,通过对目的基因TIR进行适当改造,能够有效提高目的蛋白的表达效率。; 吴健虹陈小佳朱伟杰谢秋玲孙奋勇徐万祥李菁洪岸; 关键词：猪卵透明带截短型

重组猪卵透明带-3β截短型蛋白的同源建模: 2007年; 目的:分析重组猪卵透明带-3β截短型蛋白(tunc-pZP3β)的结构,以及重组蛋白中产生强免疫原性的氨基酸序列的抗原表位。方法:利用生物信息学方法分析tunc-pZP3β的序列信息,并同源建模tunc—pZP3β的三维结构,分析抗原表位。结果:建立了tunc-pZP3β的模拟三维结构,显示出两段目的抗原表位氨基酸序列位于蛋白表面。结论:tunc-pZP3β从理论上保留着抗原表位。; 张玲谢秋玲朱伟杰陈小佳; 关键词：猪卵透明带同源模建抗原表位

猪卵透明带-3β截短型蛋白在原核系统中的表达研究被引量：3: 2005年; 目的:制备具有猪卵透明带-3β抗原活性的截短型pZP3β蛋白(tunc-pZP3β),以便对该蛋白的抗原表位区域作深入研究。方法:采用PCR方法扩增原cDNA中编码第130个氨基酸到第290个氨基酸的DNA序列。获得的tunc-pZP3β基因片段通过引入其两端的NdeⅠ和BamHⅠ酶切位点被定向插入pET-3c质粒T7强启动子下游的多克隆区,筛选出重组子,经DNA测序验证正确后,转化表达菌株BL21(DE3)pLysS,再用IPTG对重组菌体进行诱导。结果:SDS-PAGE分析表明tunc-pZP3β在大肠杆菌系统中高水平表达,且在WesternBlot免疫印迹中能被特异性抗体识别。结论:对适当的抗原表位序列进行保留而截去两端一定的氨基酸序列,所获得的截短型蛋白能够实现在大肠杆菌中高效表达,这有利于深入研究该蛋白核心区域的功能。; 孙奋勇陈小佳朱伟杰谢秋玲吴健虹徐万祥洪岸李菁; 关键词：截短型

非融合膜外型猪卵透明带-3β蛋白在原核系统中的表达被引量：5: 2005年; 目的:通过基因工程的方法在原核表达系统中表达去除了信号肽和跨膜区的膜外型猪卵透明带蛋白pZP3β。方法:设计适宜引物,采用PCR方法,在基因水平对膜外型pZP3β的翻译起始序列进行适当调整,获得的基因克隆入pET-3c载体,并进一步在大肠杆菌E.coli BL21(DE3) pLysS中表达。结果:得到表达率约10%的非融合膜外型pZP3β蛋白的表达,并经Western-blot鉴定为目的蛋白。结论:外源蛋白在不改变氨基酸序列条件下,在基因水平的适当调整可以有效提高其表达率。; 陈小佳谢秋玲朱伟杰孙奋勇徐万祥洪岸李菁吴健虹; 关键词：非融合猪卵透明带基因表达

非全长型人卵透明带-3蛋白慢病毒表达载体的构建及其在中国仓鼠卵巢细胞中表达的研究: 2007年; 目的:构建含非全长型人卵透明带-3蛋白(hZP3)的慢病毒载体,转染293FT细胞获得重组慢病毒颗粒,感染中国仓鼠卵巢细胞(CHO)使其表达hZP3。方法:将hZP3基因序列插入到慢病毒系统的入门载体pENTR-11中构建为pENTR-hZP3,采用LR重组酶将pENTR-hZP3和pLenti6/V5-DEST进行重组反应,形成新重组载体pLenti6/V5-DEST-hZP3。将该重组载体和其它viruspower 3个质粒载体充分混合,用阳离子脂质体转染293FT细胞,培养和待细胞完全裂解后收集富含hZP3基因的病毒颗粒上清液,取适量上清液感染CHO-K1细胞,采用杀稻瘟Blastcidin筛选,挑单克隆对其扩增培养,进行基因水平和蛋白水平的鉴定。结果:获得的含hZP3基因的病毒颗粒上清液滴度为1×105TU/ml,随机挑取的16株单克隆细胞中,有9株表达hZP3。结论:成功构建含hZP3的慢病毒表达载体,获得表达hZP3的CHO株,为后续研究与开发奠定了基础。; 陈小佳李丽玲朱伟杰谢秋玲洪岸李菁徐万祥; 关键词：慢病毒载体中国仓鼠卵巢细胞

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广东省科技计划工业攻关项目(2001C12001)