国家自然科学基金(30860241)
- 作品数：11 被引量：28H指数：3
- 相关作者：杨磊谭晓华罗燕张晓菲程建兵更多>>
- 相关机构：杭州师范大学石河子大学杭州师范大学临床医学院附属医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金浙江省大学生科技创新活动计划(新苗人才计划)项目浙江省自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 免疫印记和免疫荧光技术检测细胞中过表达的ABCA1蛋白表达及定位
- 2010年
- 目的:研究含有ABCA1基因的真核表达载体pcDNA3.1/ABCA1转染HeLa细胞后,在细胞中的表达及定位情况。方法:由脂质体介导将pcDNA3.1/ABCA1转入Hela细胞中,用免疫荧光法结合LSCM对细胞中ABCA1蛋白表达及定位进行检测,用蛋白质免疫印记法(Western)方法验证ABCA1蛋白的表达。结果:在LSCM下,可以清晰地观察到ABCA1蛋白在HeLa细胞中呈高表达状态,并且ABCA1蛋白已选择性的定位于细胞膜上。Western结果与之相符。结论:结合应用LSCM和免疫荧光技术能准确检测到ABCA1蛋白在HeLa细胞中的表达及定位。
- 杨丽张金莉杨兰杨磊
- 关键词：免疫荧光激光共聚焦显微镜
- 砷对巨噬细胞胆固醇流出及ABCA1、ABCG1、SRBI基因表达的影响被引量：2
- 2021年
- 目的分析砷对巨噬细胞胆固醇流出及腺苷三磷酸结合盒家族A亚家族成员1(ABCA1)、腺苷三磷酸结合盒转运体G1(ABCG1)和清道夫受体-BI(SRBI)基因表达的影响,为砷致动脉粥样硬化的机制研究提供依据。方法人髓系白血病单核细胞(THP-1)加入佛波酯诱导成巨噬细胞,与小鼠原代巨噬细胞用0、0.625、1.25、2.5和5μmol/L的亚砷酸钠处理48 h,采用荧光定量PCR和免疫印迹法检测ABCA1、ABCG1和SRBI基因表达水平;采用同位素示踪法检测胆固醇流出率。用含2.5μmol/L亚砷酸钠培养基处理巨噬细胞48 h,再换无砷培养基培养48 h,每隔12 h收集细胞,分析砷对ABCA1表达水平和胆固醇流出的时间效应。结果砷以剂量依赖方式抑制ABCA1、ABCG1的表达和胆固醇流出;5μmol/L砷处理组THP-1细胞和小鼠原代巨噬细胞中ABCA1 mRNA相对表达量分别下降69%和72%,ABCG1 mRNA相对表达量分别下降42%和34%,胆固醇流出率分别下降55%和59%(均P<0.05)。砷对SRBI的表达无明显影响(均P>0.05)。砷以时间依赖方式抑制THP-1细胞ABCA1表达和胆固醇流出,砷处理48 h时ABCA1 mRNA相对表达量和胆固醇流出率下降至最低,分别为0 h时的43%和42%;去除砷影响后ABCA1 mRNA相对表达量和胆固醇流出率逐渐恢复。结论砷通过下调巨噬细胞ABCA1和ABCG1的表达抑制胆固醇流出。
- 狄春红章云衡谭晓华杨磊
- 关键词：砷巨噬细胞胆固醇流出
- ABCA1在胆固醇逆转运中作用的研究进展被引量：12
- 2010年
- ATP结合盒转运蛋白A1(ATP-binding cassette transporter A1,ABCA1)是一种以ATP为能源进行物质转运的膜蛋白,胆固醇、磷脂等脂类物质是ABCA1的主要转运底物,胆固醇负荷、cAMP、PPAR等信号在调节ABCA1表达中有重要影响。ABCA1在胆固醇逆转运(reverse cholesterol transport,RCT)过程中与载脂蛋白结合参与高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)的形成,是RCT中的第一步也是关键的一步,也是该领域中研究的热点。
- 张晓菲谭晓华杨磊
- 关键词：ATP结合盒转运蛋白载脂蛋白高密度脂蛋白胆固醇逆转运
- ABCA1中间缺失突变体的构建及其抗砷性研究被引量：3
- 2010年
- 目的:构建缺失ABCA1,ABCA1蛋白胞外第一环第264-520位氨基酸密码子的基因,并真核表达检测其抗砷性变化。方法:应用重叠区扩增基因拼接法的原理,在拼接延伸后,再进行一次PCR扩增,得到缺失第264-520位氨基酸密码子的ABCA1基因,克隆至pcDNA3.1/V5-His真核表达载体。通过激光共聚焦检测突变体细胞定位,MTT加砷后检测突变体生存率变化。结果:成功构建缺失ABCA1蛋白胞外第一环第264-520位氨基酸密码子的基因。共聚焦显微镜观察突变体定位于细胞膜上,随机区组方差分析结果显示ABCA1突变体生存率明显低于ABCA1野生型。结论:ABCA1胞外第一环缺失突变后基本丧失抗砷功能。
- 张晓菲谭晓华程建兵李金涛孟强杨磊
- 关键词：ABCA1克隆抗砷基因
- ABCA1胞内第三环缺失突变体的抗砷性研究
- 2022年
- 目的分析ABCA1胞外第三环(第843—1348位氨基酸残基)缺失突变体的抗砷功能。方法分别转染空载体、第843—1348位氨基酸残基ABCA1缺失(ABCA1△843-1348)突变体和全长ABCA1到HeLa细胞,激光共聚焦显微镜观察其定位,CCK-8法检测急性砷暴露24 h后细胞生存率的改变,并用原子荧光吸收光谱法检测细胞内的砷蓄积量。结果激光共聚焦结果表明,突变体与全长ABCA1都定位在细胞膜上。突变体和全长ABCA1转染组在各砷浓度处理条件下的生存率没有差异(P>0.05),均高于空载体对照组(Ρ<0.05)。转染空载体、全长和突变体ABCA1细胞24 h半数抑制浓度IC50值分别为19.17μM、31.64μM、29.73μM。10μM亚砷酸钠处理条件下,转染全长和突变体ABCA1细胞内砷含量在4 h后趋于稳定,而转染空载体的细胞内砷含量仍持续升高,3组差异有统计学意义(Ρ<0.05)。转染全长和ABCA1△843-1348突变体细胞内各个时间点的砷含量没有差异(P>0.05)。结论ABCA1△843-1348突变体仍具有抗砷性,提示该区域不是ABCA1抗砷的关键功能结构域。
- 章云衡狄春红罗燕谭晓华杨磊
- 关键词：抗砷基因ABCA1
- ABCA1胞外第四环缺失突变体的构建及其抗砷性初步研究被引量：2
- 2010年
- 目的:构建ABCA1细胞外第四环第1479～1597位氨基酸残基缺失的突变体。方法:采用重叠区扩增基因拼接法构建ABCA1第1479～1597位氨基酸残基缺失的突变体基因,并将其克隆至pcDNA3.1/V5-His/ABCA1重组载体上,脂质体法转染Hela细胞,激光共聚焦观察突变体定位,Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒检测其48h急性砷中毒后生存率的变化。结果:该突变体基因经DNA序列分析表明其具有正确的序列和阅读框。激光共聚焦证实其表达的蛋白仍然能正确定位在Hela细胞的细胞膜上。CCK-8结果显示转染重组质粒和突变体质粒的细胞在各种砷浓度下生存率都较空载体组高。结论:成功构建了ABCA1胞外第四环第1479～1597位氨基酸残基缺失的突变体,且其表达的蛋白仍然定位于细胞膜上,突变体仍然具有一定的抗砷性,提示ABCA1胞外第四环可能不是关键抗砷结构域。
- 程建兵谭晓华罗燕杨磊
- 关键词：ABCA1突变体重叠区扩增基因拼接法
- 砷诱发THP-1巨噬细胞氧化应激及抑制ABCA1表达诱导细胞凋亡被引量：2
- 2019年
- 目的探究砷对THP-1巨噬细胞氧化应激和ABCA1基因表达的影响以及诱导细胞凋亡的可能机制。方法分别以0、4、8和12μmol偏亚砷酸钠染毒THP-1巨噬细胞48 h,抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)预处理1 h后,CCK-8检测细胞生存率;流式细胞术DCFH-DA染色法检测细胞内活性氧(ROS)的生成;RT-PCR检测细胞内ABCA1基因的表达。砷处理的同时加入50 g/L氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)培养48 h,油红O染色检测细胞内脂质富集,流式细胞术Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡情况。结果随着砷处理浓度升高,ROS生成量明显上升(P<0.01);ABCA1基因表达下调(P<0.001);脂质富集和凋亡比例增加(P<0.05)差异有统计学意义。加入NAC后ROS产生明显下降;ABCA1基因表达上调(P<0.001);脂质富集和凋亡情况明显缓解(P<0.001),差异有统计学意义。结论砷能够通过氧化应激的途径诱导细胞凋亡,并下调ABCA1基因的表达,增强细胞内脂质富集。
- 刘雅倩周通张瑜宋杨杨磊
- 关键词：砷THP-1巨噬细胞细胞凋亡ROSABCA1
- 三磷酸腺苷结合盒转运体A1蛋白第二跨膜结构域缺失突变体的构建及其抗砷性研究被引量：3
- 2012年
- 目的检测三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ABCA1)蛋白第2跨膜结构域(the second transmembrane domain,TMD2)中关键的抗砷结构域。方法采用重叠区扩增基因拼接法构建三磷酸腺苷结合盒转运体A1基因TMD2的一系列缺失突变体,分别转染至HeLa细胞,激光共聚焦观察其定位,Cell Counting Kit-8检测48 h急性砷中毒后生存率的变化,原子荧光吸收光谱法检测细胞内的总砷含量。结果激光共聚焦证实各突变体的编码蛋白均定位在HeLa细胞的细胞膜上。CCK-8结果显示,转染胞外第4、5环,胞内第4、5环缺失突变体的HeLa细胞IC50分别为33.18、32.84、33.45、34.29μmol.L-1,与转染野生型三磷酸腺苷结合盒转运体A1质粒的HeLa细胞(IC50为33.96μmol.L-1)无显著差异,均高于空载体转染对照组(IC50为19.01μmol.L-1)。转染胞外第6环缺失突变体HeLa细胞的IC50为19.95μmol.L-1,与空载体对照组无显著差异,显著低于野生型三磷酸腺苷结合盒转运体A1质粒转染组。原子荧光分光光度法结果显示,转染胞外第6环缺失三磷酸腺苷结合盒转运体A1的HeLa细胞内砷含量与转染空载体接近,而转染其他突变体的结果与转染野生型三磷酸腺苷结合盒转运体A1的结果基本一致。结论成功构建了5个三磷酸腺苷结合盒转运体A1蛋白第2跨膜结构域的缺失突变体,且其表达的蛋白仍然正确定位于HeLa细胞的细胞膜上。突变体(除胞外第6环外)仍然具有一定的抗砷性,提示三磷酸腺苷结合盒转运体A1胞外第6环可能是关键抗砷结构域。
- 罗燕程建兵谭晓华尹小菲杨磊
- 关键词：三磷酸腺苷结合盒转运体A1突变体重叠区扩增基因拼接法
- 人脐静脉内皮细胞水通道蛋白9磷酸化与砷耐受性的关系被引量：3
- 2013年
- 目的探讨人脐静脉内皮细胞株ECV-304和抗砷性ECV-304(AsRE)细胞株中水通道蛋白AQP9的表达及其磷酸化水平以及其对亚砷酸钠(NaAsO2)耐受性之间的关系。方法 采用CCK8法测定NaAsO22.5～40μmo.l L-1作用24 h对ECV-304和AsRE细胞株的毒性。NaAsO22.5～20μmol.L-1处理ECV-304和AsRE细胞株2 h,实时定量PCR法测定AQP9 mRNA表达水平,Western印迹法检测AQP9和p38蛋白表达水平;免疫印迹法检测AQP9蛋白磷酸化水平;电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)法测定细胞内砷含量。结果 NaAsO2在AsRE和ECV-304细胞的IC50分别为12.59和4.06μmol.L-1。在NaAsO2同浓度下,AsRE细胞内砷摄入量均低于ECV-304细胞(P<0.05)。NaAsO2处理ECV-304和AsRE细胞后,AQP9 mRNA表达水平均有所下调,但在AsRE细胞中的下调幅度显著高于ECV-304细胞(P<0.05);AQP9蛋白水平在AsRE细胞呈浓度增加而下降,而ECV-304细胞中则无明显变化;ECV-304细胞中AQP9磷酸化水平随浓度有所上升,AsRE细胞中AQP9磷酸化水平则一直维持在更高的表达水平。NaAsO2处理后,p38蛋白及其磷酸化水平在两个细胞株间无明显变化。结论 AsRE细胞中AQP9的磷酸化水平与砷耐受性有明显相关性,其可能机制是AQP9通过影响细胞对砷的摄入影响砷的耐受性。
- 曹亦菲谭晓华黄仙红何平连福治邓卢翠杨磊
- 关键词：水通道蛋白9亚砷酸盐类砷中毒
- 水通道蛋白9磷酸化对哺乳动物细胞中砷摄入的影响被引量：3
- 2012年
- 目的研究水通道蛋白9(AQP9)mRNA表达水平、水通道蛋白9及p38蛋白表达及其磷酸化水平对肝癌细胞HepG2和肝正常细胞L-02砷摄入的影响,探讨水通道蛋白9磷酸化的调控机制。方法采用电感藕合等离子体质谱法(ICP-MS)测定细胞内砷含量。采用实时定量PCR、免疫印迹法和免疫共沉淀技术分别检测不同处理后两细胞株中水通道蛋白9 mRNA、水通道蛋白9和p38蛋白表达水平及其磷酸化水平。采用SPSS统计软件分析实验数据。结果 HepG2细胞内砷含量及摄入速度高于L-02细胞。HepG2细胞的水通道蛋白9 mRNA表达水平在6 h内随NaAsO2处理时间延长而显著增加(P<0.05),而在L-02细胞无明显变化。在2 h时,HepG2细胞水通道蛋白9基因表达水平在各NaAsO2处理浓度均显著增加(P<0.05)。免疫沉淀实验结果显示,HepG2细胞中水通道蛋白9蛋白磷酸化水平随NaAsO2处理时间和浓度的增加而增加,而L-02细胞在各时间和浓度处理点水通道蛋白9蛋白磷酸化水平与对照相比明显增加,但处理间无明显差异;p38的磷酸化水平在两种细胞中均随砷处理时间延长而增加;SB203580抑制p38活性后能完全取消L-02细胞水通道蛋白9蛋白的磷酸化,而对HepG2细胞水通道蛋白9蛋白磷酸化无明显影响。结论水通道蛋白9的表达及磷酸化水平可能在调节细胞砷摄入中发挥重要作用,在不同细胞中水通道蛋白9蛋白磷酸化的调控机制有所差异。
- 曹亦菲杨磊邓卢翠黄仙红罗燕何平徐玲李思萱谭晓华
- 关键词：水通道蛋白9磷酸化P38HEPG2L-02
