国家自然科学基金(81202338)
- 作品数：12 被引量：25H指数：4
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- 相关领域：生物学医药卫生理学更多>>
- hFcεRIα/RBL-2H3细胞株的构建与评价被引量：3
- 2015年
- 目的构建稳定表达人FcεRIα(h FcεRIα)亚基的RBL-2H3细胞株。方法利用RT-PCR技术克隆h FcεRIα基因,构建真核表达载体p CI-neo-h FcεRIα。脂质体介导法转染RBL-2H3细胞,G418筛选获得稳定转染细胞株。利用RT-PCR、Western blot及免疫荧光法鉴定转染结果。结果通过对脂质体介导转染体系进行优化,转染效率可高达75.38%。经Western blot、免疫荧光及RT-PCR鉴定,h FcεRIα基因在RBL-2H3细胞内成功表达。结论成功构建h FcεRIα/RBL-2H3细胞模型,为深入研究Ig E与FcεRI作用机制及相关药物开发提供了实验基础。
- 王南南刘中成张艳芬刘玉欣崔哲陈瑶
- 关键词：IGERBL-2H3细胞脂质体转染
- 核酸适配子在小分子检测中的应用
- 2015年
- 核酸适配子是利用配体指数级富集系统进化技术从单链寡核苷酸文库中筛选出的与靶物质有高亲和力和特异性的寡核苷酸,它已成为小分子化合物研究的有效工具,在分析化学领域逐渐成为人们研究的热点。当前已筛选了许多小分子物质特异性适配子,并基于适配子开发了一系列小分子物质检测系统。本文主要对SELEX筛选流程、小分子物质核酸适配子筛选特征与方法以及以核酸适配子为基础开发的电化学法、荧光法、胶体金比色法、酶联适配子免疫法等在小分子物质检测中的应用进行了综述。
- 张艳芬解瑶王南南赵丽建刘利鹏刘中成
- 一种适用于SELEX技术的单链DNA制备方法被引量：1
- 2014年
- 为了建立一种简单、高效制备高纯度单链DNA方法,用于SELEX技术筛选过程中次级文库的筛选,对制备链霉亲和素磁珠的实验条件进行了优化,确定了对称PCR产物与链霉亲和素磁珠偶联的最佳时间和饱和度,并验证了不同浓度NaOH对解链效果的影响,建立了适于SELEX技术的单链DNA制备体系。利用荧光法和聚丙烯酰胺凝胶电泳对本实验所建立方法及传统不对称PCR法制备单链DNA的回收效率和纯度进行了比较,结果表明在最优实验条件下用磁性分离法制备的单链DNA纯度及回收效率均显著高于不对称PCR法。
- 刘中成解瑶张艳芬赵丽健刘利鹏肖敏华
- 关键词：SELEX技术单链DNA
- RBL-2H3细胞脱颗粒模型研究被引量：6
- 2018年
- RBL-2H3细胞是体外研究变态反应的常用细胞,为了建立RBL-2H3细胞脱颗粒检测模型,以C48/80作为阳性药物,分析比较了细胞形态观测法、台盼蓝染色法、β-氨基己糖苷酶释放率及钙离子质量浓度检测等细胞脱颗粒检测方法.通过对C48/80作用质量浓度及时间的摸索,建立C48/80刺激RBL-2H3细胞脱颗粒的最佳药物作用条件.结果表明,β-氨基己糖苷酶释放率与细胞脱颗粒程度存在显著量-效关系,且操作简单、结果稳定.C48/80工作质量浓度为60μg/mL,最佳作用时间40 min.在此基础上,优化了DNPIgE/DNP-BSA诱导细胞脱颗粒体系,0.4μg/mL DNP-IgE致敏RBL-2H3细胞过夜,10μg/mL DNP-BSA诱导细胞,细胞脱颗粒程度最严重.同时发现,不同释放介质对DNP-BSA诱导细胞脱颗粒有显著影响.该结果可为变态反应相关研究提供实验基础.
- 刘中成刘世芳李飞王南南王南南袁欣张艳芬
- 关键词：脱颗粒变态反应
- 大鼠sFcγRIIb基因原核表达及活性鉴定
- 2016年
- 旨在克隆大鼠FcγRIIb基因,构建s FcγRIIb原核表达体系,制备重组大鼠s FcγRIIb蛋白。采用RT-PCR技术从RBL-2H3细胞中克隆FcγRIIb胞外区基因,构建重组表达质粒转化大肠杆菌诱导表达,镍柱亲和层析纯化重组蛋白,复性后利用Western blotting、ELISA进行鉴定。结果显示,成功克隆大鼠s FcγRIIb基因,构建原核表达载体s FcγRIIb-p ET17b,转化大肠杆菌BL21(DE3)。通过对表达体系进行优化,确定IPTG浓度为1.0 mmol/L,诱导时间为4 h时蛋白表达效率最高,重组蛋白主要以包涵体形式存在。包涵体经8 mol/L尿素溶解,利用Ni-NTA柱亲和层析获得了较高纯度的重组蛋白。采用梯度透析复性法对s FcγRIIb进行复性后,经Western blotting、ELISA与竞争性ELISA鉴定,重组蛋白s FcγRIIb可被特异性抗体所识别且与Ig G具有结合能力。成功建立了大鼠FcγRIIb基因原核表达体系,制备了具有生物学功能的重组蛋白。
- 张艳芬刘利鹏陈瑶崔哲毕克维王南南刘中成
- 关键词：抑制性受体原核表达重组蛋白
- sFcγRⅡb蛋白结合肽的筛选与鉴定
- 2019年
- FcγRⅡb是免疫球蛋白G受体(FcγR)中唯一的抑制型受体,在免疫反应的负性调节方面发挥重要作用.为了筛选sFcγRⅡb的蛋白结合肽,以重组sFcγRⅡb蛋白为靶分子,采用噬菌体肽库展示技术对sFcγRⅡb结合肽进行筛选.利用ELISA鉴定每轮洗脱噬菌体与sFcγRⅡb蛋白亲和力,经过4轮筛选,挑取40个噬菌体克隆进行序列测定,获得28种不同的12肽序列.经ELISA法鉴定噬菌体与sFcγRⅡb蛋白结合活性,得到sFcγRⅡb蛋白高特异性、高亲和力结合肽FHKMPWYMSMYY,为进一步研究FcγRⅡb的作用机制和探索结合肽的功能提供实验基础.
- 徐臻臻刘利鹏张艳芬崔哲崔哲刘中成
- 关键词：结合肽
- 核酸适配子在IgE检测中的应用被引量：1
- 2013年
- 核酸适配子是一类经SELEX技术筛选出来的寡聚核苷酸,其功能与单克隆抗体类似但在诸多方面明显优于抗体,可用于测定靶物质含量等。免疫球蛋白E(immunoglobulin E,IgE)是介导过敏反应的关键因子,IgE定量检测是临床诊断过敏性疾病的重要指标。该文主要综述了核酸适配子在IgE检测中的应用。
- 刘中成赵丽君张艳芬解瑶时海浪
- 关键词：IGE
- 适于标记核酸适配子胶体金的制备及性能被引量：4
- 2014年
- 为了获得适于标记寡核苷酸适配子的胶体金,对制备工艺条件进行了优化：20 mL 0.1 g/L氯金酸溶液中添加10 g/L柠檬酸三钠500 μL,pH=3.0,初始沸腾时间小于4 min,加入还原剂后反应时间为6 min.通过紫外可见光谱扫描和透射电镜对其性能进行鉴定,获得了分散均匀、直径15～20 nm的胶体金颗粒,可准确标记核酸适配子,且将胶体金标记的链霉素适配子与半抗原小分子链霉素进行反应,可对链霉素进行定性和半定量检测,满足利用胶体金标记适配子检测靶物质的需要.
- 解瑶刘中成张艳芬赵丽健刘利鹏
- 关键词：胶体金
- Cε3-Cε4结合肽筛选及鉴定
- 2014年
- 为了获得免疫球蛋白E(IgE)特异性结合肽,采用固相筛选法,以Cε3-Cε4为靶蛋白,利用噬菌体随机多肽展示技术进行筛选,4轮筛选后,经ELISA鉴定获得19个阳性单克隆噬菌体,阳性率达38%,测序并翻译后共获得11个结合肽.竞争抑制性实验证明P7,P13,P20与Cε3-Cε4蛋白的结合能力较强,细胞水平分析表明:结合肽P7,P20可阻止IgE与其受体结合.本研究将为进一步探索IgE结合肽生物学功能奠定基础,并为设计治疗变态反应性疾病的小分子药物提供参考.
- 张艳芬刘利鹏赵立健时海浪刘中成
- Cε3-Cε4蛋白核酸适配子筛选与鉴定被引量：6
- 2012年
- 设计并合成随机ssDNA文库,以硝酸纤维素膜为筛选介质,利用SELEX技术筛选人Cε3-Cε4蛋白特异性高亲和力核酸适配子,通过对退火温度、循环次数及靶蛋白与ssDNA摩尔比等关键参数进行优化,建立了适合的筛选体系。ELISA测定各适配子亲和力,获得了人Cε3-Cε4蛋白高亲和力、高特异性适配子,并分析了其一级结构和二级结构。以所获高亲和力适配子分别作为捕获适配子和检测适配子,建立了酶联适配子吸附试验(enzyme-linked aptamers sorption assay,ELASA)方法,灵敏度达到120 ng.mL-1,可用于人IgE的定量检测。
- 刘中成赵丽君张艳芬时海浪解瑶
- 关键词：免疫球蛋白E适配子
