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具有八肽重复区突变的朊蛋白其抗氧化性降低被引量：1: 2008年; 抗氧化性被认为是细胞朊蛋白的主要生理功能之一,研究显示它的抗氧化性主要与朊蛋白序列中的八肽重复区有关.但是迄今为止它的抗氧化机制仍旧不清楚.我们构建表达了野生型朊蛋白(PrP-PG5)和它的不同八肽重复区突变体0(PrP-PG0),9(PrP-PG9)和12(PrP-PG12).各种原核表达突变体蛋白在H2O2氧化后出现分子量的增加,并可导致羰基产生.MTT和细胞计数实验显示表达各种突变体的细胞存活率明显低于表达野生型朊蛋白(PrP-PG5)的细胞.细胞内ROS检测发现表达各种突变体的细胞内ROS水平明显高于表达野生型朊蛋白(PrP-PG5)的细胞.此外,谷胱甘肽过氧化物酶检测显示表达野生型朊蛋白(PrP-PG5)的细胞内谷胱甘肽过氧化物酶水平明显高于表达各种突变体的细胞.H2O2处理细胞后,转染突变体的细胞总的羰基产物数量明显高于转染野生型朊蛋白(PrP-PG5)的细胞,而表达突变体细胞及转染空载体的细胞较表达野生型朊蛋白(PrP-PG5)的细胞对氧化物质的抵抗性明显减弱.这些结果提示,具有正确八肽重复区数目对于朊蛋白(PrP)的抗氧化作用起关键作用,PrP的抗氧功能的丢失可能参与家族性朊病毒病的病理过程.; 安润董辰方雷艳君韩露李平陈建明王桂荣石琦高晨姜慧英周伟韩俊楚雍烈董小平; 关键词：PRP 抗氧化性谷光甘肽过氧化物酶细胞活性

细胞浆中PrP蛋白的表达及其细胞毒性作用的研究被引量：1: 2008年; 为了探讨在胞浆中表达的PrP的理化特征以及对细胞活性的影响,我们构建了胞浆型PrP(CytoPrP)真核表达质粒,瞬时转染人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞,通过蛋白酶敏感性实验检测CytoPrP及其蛋白酶抗性,利用MTT和Trypan Blue细胞计数检测CytoPrP的细胞毒性作用。结果显示,CytoPrP在胞浆内的存在受蛋白酶抑制剂的控制;与野生型PrP相比,CytoPrP具有相对较强的蛋白酶K(PK)抗性。MTT和细胞计数实验均显示,Cyto-PrP的存在可诱导明显的细胞毒性效应,而CytoPrP的细胞毒性作用受蛋白酶抑制剂含量的影响,呈剂量依赖关系。上述结果为研究CytoPrP在朊病毒病的发病机制中的意义提供了一定的科学数据。; 王新董辰方石琦石崧王桂荣雷艳君安润徐琨姜慧英韩俊赵玉军董小平; 关键词：朊病毒细胞毒作用

一种基于连续PMCA的PrP^Sc体外扩增方法的建立被引量：1: 2008年; 为建立一种基于蛋白质错误折叠循环扩增(PMCA)的体外稳定扩增方法以观察PrPSc是否能在体外连续传代,我们分别制备了正常仓鼠和羊瘙痒病因子263K感染的发病仓鼠的全脑匀浆,将两种脑匀浆以不同体积比混合后,分别进行144个循环的直接PMCA和每轮48个循环、共8轮的连续PMCA,用Western blot对PrPSc的扩增情况进行检测。结果显示,与常规的直接PMCA方法相比,连续PMCA能更有效地使低浓度的PrPSc扩增到可检出的水平,表明连续PMCA可以支持羊瘙痒因子263K在体外长期稳定的复制。连续PMCA方法是一种体外高效地扩增PrPSc的方法,有潜力成为一种Prion体外培养方法,用于研究Prion错误折叠和复制机制,以及检测脑组织、外周组织和体液样品中的微量PrPSc。; 石崧董辰方张宝云石琦王桂荣王新韩俊董小平; 关键词：PRION病

中国2008年克雅氏病监测病例特征分析被引量：10: 2009年; 目的了解中国克雅氏病（CJD）的发病情况及流行病学、临床特征。方法对2008年中国克雅氏病监测网络获得的可疑CJD病例的临床及流行病学资料进行分析，收集患者脑脊液及血液样品，利用Western blot方法检测脑脊液中是否含有14—3—3蛋白，提取全血基因组DNA并利用PCR及测序方法对PRNP基因进行129位多态性及基因突变分析。结果共发现散发型CJD临床诊断病例31例，疑似诊断病例11例，2例家族性CJD和1例格-斯-斯综合征。病例的地理分布及职业无明显聚集性；临床诊断病例发病平均年龄56．7岁，男女比例8：9；疑似诊断病例发病平均年龄为57．4岁，男女比例5：6。快速进行性痴呆为最常见的首发症状，占全部诊断病例的33．3％。临床诊断病例比疑似诊断病例出现更多的典型临床表现。结论2008年中国监测到的CJD病例以散发型为主，病例的地理分布、职业、性别比例以及平均年龄均符合散发型CJD的分布特点。; 田婵高晨石琦韩俊周伟张宝云高永军董小平; 关键词：克雅氏病

脑脊液特定蛋白在散发型克雅氏病诊断中作用被引量：3: 2009年; 王桂荣田婵董小平; 关键词：脑脊液特定蛋白

人doppel蛋白及其类似蛋白PrPΔ32-121对SH-SY5Y细胞的细胞毒性作用被引量：1: 2010年; 目的体外观察细胞瞬时表达的人Dpl(doppel)蛋白对人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的作用,并与其结构类似蛋白——截短型PrP(PrPΔ32-121)加以比较。方法通过PCR方法获得人PRND基因及截短型PRNP基因并克隆至真核表达载体,瞬时转染SH-SY5Y细胞后,观察蛋白表达及其定位情况;采用MTT实验检测转染细胞的生长状态;用流式细胞仪、Western blot等方法检测转染细胞的凋亡状态。结果两种蛋白均可在转染细胞中表达,并存在于细胞膜上;MTT结果显示,在转染24 h后均出现明显的细胞毒性作用;细胞凋亡相关实验发现,转染细胞AnnexinV/PI双染阳性细胞数量增多,pro-casepase-3和Bcl-2因子水平降低。结论瞬时表达的Dpl蛋白与截短型PrP可产生类似的神经细胞毒性作用,并诱导启动细胞凋亡过程。; 徐琨王新田婵石崧王桂荣石琦周瑞敏姜惠英楚雍烈董小平; 关键词：朊蛋白细胞毒性作用细胞凋亡

蛋白激酶CK2与PrP蛋白的体外相互作用研究: 2008年; 为了探讨蛋白激酶CK2与PrP是否存在分子间相互作用,利用RT-PCR方法从人源细胞系SH-SY5YcDNA中分别扩增出蛋白激酶CK2α和CK2β基因,并在E.coli中表达了融合蛋白HIS-CK2α和GST-HIS-CK2β。利用pull-down及免疫共沉淀实验检测PrP与CK2的分子间相互作用。结果显示,重组PrP可与CK2α出现特异性结合,但不与CK2β发生反应。天然状态下脑组织中的CK2与PrPC也发生相互作用。PrP与CK2α亚基相互作用的区域位于PrP的C-端90～231位氨基酸。本研究从分子水平上提供了人重组和天然CK2和PrP蛋白相互作用的实验依据,为深入探讨CK2与朊蛋白作用的生物学意义和在朊病毒病发病过程中的作用提供了科学线索。; 陈建明高晨石琦高永军雷艳君单冰董辰方王桂荣石崧韩俊董小平; 关键词：朊蛋白酪蛋白激酶蛋白相互作用

我国人类朊病毒病检测监测体系建立及相关基础和应用研究被引量：3: 2010年; 目的在我国开展克雅氏病(CJD)监测,探讨朊病毒病的发病机制。方法采用多学科交叉技术开展以疾病监测为导向的应用研究和发病机制为导向的基础研究。结果建立了CJD病原学诊断技术,制定了《克雅氏病诊断标准》,开展了覆盖12个省(市)自治区的CJD监测。首次较全面地了解了我国CJD病人的流行病学、临床和实验室特征;首次报道了我国多种遗传型CJD病例。建立了包括朊病毒实验动物平台、体外无细胞转化平台、PMCA平台、PrPSc抗原库等技术平台。首次发现了朊病毒可利用脾脏和肌肉组织进行复制、NADPH可促进PrPSc增殖;系统描述了PrPSc和其他神经因子在疾病潜伏期和终末期的变化;报道了PrP蛋白与多种神经蛋白发生相互作用;证明了PrP蛋白序列、二级结构、糖基化类型及胞内存在位置的改变均可诱导细胞凋亡。结论本研究直接服务于我国朊病毒病的防控工作,为朊病毒的研究积累了重要的科学数据。; 董小平洪涛韩俊高晨石琦张宝云周伟田婵姜慧英屈建国张瑾董辰方张莹赵同兴; 关键词：朊病毒克雅氏病发病机理

感染羊瘙痒因子263K株或139A株仓鼠脑组织中tau蛋白和磷酸化tau蛋白变化的研究: 2009年; 为探讨朊病毒病的神经病理特征,应用Western blot方法检测了感染羊瘙痒因子263K株或139A株的仓鼠脑组织中总tau蛋白和Ser396和Ser404位点发生磷酸化tau蛋白表达水平的变化;并应用Real Time PCR方法检测了tau mRNAs转录活性的改变。结果表明总tau蛋白含量升高而Ser396和Ser404位点发生磷酸化的tau蛋白含量降低,该现象与羊瘙痒因子毒株类型和临床潜伏期无关;感染羊瘙痒因子的仓鼠脑组织中Tau2和Tau4这两个异构体的转录水平升高。这些结果表明tau蛋白在Ser396和Ser404位点的去磷酸化可能与朊病毒病发病相关。; 王桂荣石崧高晨张宝云田婵董辰方周瑞敏李晓丽陈操韩俊董小平; 关键词：朊病毒 TAU蛋白磷酸化TAU蛋白

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国家科技攻关计划(2006BAD06A13-2)

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