博士科研启动基金(XB1007)
- 作品数：4 被引量：3H指数：1
- 相关作者：郑克勤庞实锋曹定国廖霞周汝滨更多>>
- 相关机构：广东医学院更多>>
- 发文基金：博士科研启动基金教育部科学技术研究重点项目广东省大学生创新实验项目更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 红色荧光蛋白核迁移蛋白shRNA干扰载体的构建被引量：3
- 2011年
- 目的:利用红色荧光蛋白(RFP),建立一种直观、快速筛选有效RNA干扰片段的方法。方法:通过分子克隆技术将核迁移蛋白(NUDC)与RFP构建成融合基因,克隆至真核表达载体pDs中,以实现其融合表达;同时,将人U6启动子及9个NUDC的发夹结构分别克隆至上述同一真核载体中,构建成一系列针对NUDC不同干扰位点的RNA干扰载体,通过采用酶切及DNA序列鉴定,然后转染293T细胞,通过荧光显微镜观察293T细胞的荧光发光强度及荧光细胞数。结果:酶切及测序结果证实质粒为所需的序列;荧光显微镜观察结果显示,shNUDC-A的干扰效果最好。结论:成功构建了含RFP的NUDC真核shRNA干扰载体。
- 廖霞庞实锋张强杨芳郑克勤周汝滨曹定国邹宇光
- 关键词：融合基因RNA干扰SHRNA
- 一种具杀菌功能的haFGF融合基因在毕氏酵母中的表达
- 2010年
- 目的构建一种双功能活性多肽,实现其在酵母中的表达。方法通过体外DNA重组技术将cecropin AD连接在haFGF的5′端,构建成融合基因CADAF,将其克隆到分泌表达载体pPICZαA上,然后转化到毕氏酵母受体菌X-33中进行甲醇诱导表达。结果经SDS PAGE和Western blot分析,构建的CADAF基因在酵母中获得了表达,经抑菌实验及MTT实验结果表明,融合蛋白具有一定的抗菌功能和促细胞分裂活性。结论成功实现了haFGF与抗菌肽的在酵母中的融合表达,为多功能细胞生长因子在创伤治疗中的应用打下了基础。
- 庞实锋付宏岐郑克勤廖霞梁朋曹定国陈小萍周汝滨
- 关键词：人酸性成纤维细胞生长因子抗菌肽融合基因毕氏酵母
- 用流式细胞仪进行人核迁移蛋白shRNA有效干扰片段的分析和筛选
- 2012年
- 目的为了更好地利用流式细胞仪筛选出有效的RNA干扰片段,构建了一系列真核表达载体pDs-NUDC-RFP-TK-U6-shNUDC-A、B、C、D、E、F、H。方法将NUDC-RFP融合基因克隆至pDs载体中,构建出pDs-NUDC-RFP.载体;将人U6启动子克隆至pDs-NUDC-RFP.载体中;将shNUDC-A、B、C、D、E、F、H各个片段分别克隆至含有U6启动子的载体中,形成一系列RNA干扰载体pDs-NUDC-RFP-TK-U6-shNUDC-A、B、C、D、E、F、H;将提取高质量的质粒通过脂质体方法转染293T细胞。用流式细胞仪分析转染的293T细胞的荧光强度和荧光细胞数量,用实时荧光相对定量RT-PCR(real-time PCR)检测NUDC-RFP mRNA的转录情况,用Western Blot法检测NUDC-RFP融合蛋白的表达水平。结果流式细胞仪检测结果显示:空白对照组的293T细胞无发光细胞;阴性对照组的293T细胞能正常发光,且发光细胞数量较多;实验组的293T细胞发光细胞数量少,荧光强度低,说明其能有效干扰NUDC-RFP融合基因的表达,pDs-NUDC-RFP-TK-U6-shNUDC-F干扰下调效果约90%左右;pDs-NUDC-RFP-TK-U6-shNUDC-A可干扰hNUDC-RFP融合基因的表达,下调效果约85%左右;其他干扰片段pDs-NUDC-RFP-TK-U6-shNUDC-B、C、D、E、H下调效果在62%～75%;阴性对照组对融合基因无干扰效果;流式细胞仪检测结果与real-time PCR检测结果一致,也与Western Blot法的鉴定结果基本符合,并确定了shNUDC-F为RNA干扰效果最佳的干扰片段。结论流式细胞仪分析方法是一种有效的带荧光标记的RNA干扰载体的筛选方法,为后期研究打下了基础。
- 廖霞邹宇光庞实锋郑克勤周汝滨曹定国梁朋胡传银
- 关键词：红色荧光蛋白融合基因流式细胞仪
- 人核迁移蛋白shRNA慢病毒载体的构建及转导
- 2012年
- 目的:通过绿色荧光蛋白(GFP)标记,构建可示踪的人核迁移蛋白(hNUDC)慢病毒RNA干扰载体,并实现其对靶细胞的转导。方法:通过分子克隆技术将人核迁移蛋白的发夹RNA(shNUDC-F)克隆至慢病毒表达载体中,构建成靶向针对hNUDC的RNA干扰载体,通过磷酸钙转染法,将获得的慢病毒高纯度质粒转染进低次代293T细胞中进行包装,通过高速离心收获慢病毒颗粒,经滴度测定后,对Dami巨核细胞进行转导实验。用显微镜观察转导效率,用Westernblot检测RNA干扰效果。结果:慢病毒携带的shNUDC-F片段对Dami巨核细胞能高效转导,并使其内源hNUDC基因发生基因沉默,干扰效果较好。结论:成功构建出慢病毒hNDUC RNA干扰载体,并在293T细胞中实现包装并成功转入Dami细胞。
- 庞实锋廖霞郑克勤周汝滨梁朋曹定国张国平李文荣
- 关键词：慢病毒RNA干扰发夹RNA巨核细胞
