国家教育部博士点基金(20101301120005)
- 作品数：5 被引量：23H指数：3
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- 家蝇溶菌酶2基因的克隆及其性质研究被引量：10
- 2011年
- 溶菌酶(lysozyme)作为抗菌肽重要一员,在昆虫先天免疫系统中起着重要作用。本文通过家蝇EST序列筛选并结合RACE技术克隆了家蝇Musca domestica的lysozyme2基因(Md-lysozyme 2,MdL2)全长516bp的cDNA序列。MdL2包含429bp的开放阅读框,编码142个氨基酸残基,推导的氨基酸序列N端包括20个氨基酸残基的信号肽,成熟肽由122个氨基酸残基组成,理论分子量为13.89kD,理论等电点为6.45,有8个半胱氨酸组成4对分子内二硫键。实时荧光定量PCR结果显示大肠杆菌和金黄色葡萄球菌分别刺激后,家蝇幼虫体内MdL2基因的表达模式发生了非常相似的变化。在刺激3～12h表达下调,12～24h出现一个短暂的恢复,在刺激24h后表达又开始下调。不同组织定量PCR结果表明MdL2表达量在肠和血细胞中较高,而在表皮和脂肪体中较低。MdL2成熟肽编码序列被克隆入pET-DsbA表达载体,并转化大肠杆菌后得到高效表达。
- 郑立李娟郭亚伟柳峰松
- 关键词：家蝇基因克隆
- 中国明对虾卵黄蛋白原基因启动子克隆与分析被引量：1
- 2013年
- 为了探明中国明对虾卵黄蛋白原基因启动子表达调控机制,利用DNA步移法克隆了中国明对虾卵黄蛋白原基因启动子及其上游调控序列,总长1 100bp.分析表明,在基因转录起始位点上游-30～-24bp处有1个TATA box,未发现有CAAT box和GC box.同时,在上游调控区还存在有多个可能影响启动子转录活性的顺式作用元件,如NF-κB,YY1和SP1等转录因子结合位点.这些结果为深入研究中国明对虾卵黄蛋白积累及卵子发生过程奠定了基础.
- 谢松李理想陈宏健孙玲玲柳峰松
- 关键词：卵黄蛋白原启动子顺式作用元件
- 家蝇抗菌肽Attacin-2基因的克隆、序列分析和诱导表达被引量：12
- 2011年
- 攻击素(attacin)作为昆虫抗菌肽之一,在昆虫的先天免疫中起着重要作用。本研究通过家蝇Musca domesticaEST序列筛选并结合RACE技术克隆了家蝇的Attacin-2基因(Mdatta2)cDNA序列。其全长819 bp,包含一个726 bp的完整开放阅读框(open reading frame,ORF),以及42 bp的5'末端非翻译区(5'UTR)和51 bp的3'末端非翻译区(3'UTR),编码241个氨基酸残基,推导的多肽N端22个氨基酸残基为信号肽序列。同源性分析表明,其氨基酸序列与嗜凤梨果蝇Drosophila ananassae的Attacin一致性最高(46%)。以邻接法(Neighbor-Joining,NJ)构建的系统关系表明,家蝇的Attacin-2与其他双翅目昆虫的Attacin起源于共同的祖先,属于Attain_C超家族。应用实时荧光定量PCR的方法研究家蝇幼虫在受到外源细菌刺激时Mdatta2基因的表达,结果显示,在大肠杆菌Escherichia coli和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus分别刺激后3 h和6 h,家蝇幼虫Mdatta2表达量出现显著上调。Mdatta2基因在家蝇幼虫体内呈诱导型表达,表达水平随诱导时间的不同而变化,提示Mdatta2基因可能在家蝇免疫防御过程中起着重要作用。
- 柳峰松孙玲玲唐婷王丽娜
- 关键词：家蝇抗菌肽基因克隆基因表达
- 大鼠LC3蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备被引量：2
- 2011年
- 微管相关蛋白1轻链3-β(LC3)在哺乳动物细胞中定位于自噬泡上,可作为一种特定的标记用来检测自噬。从SD大鼠脑组织提取总RNA,经RT-PCR扩增得到LC3全长编码基因,并克隆到pMD1 8-T载体。以测序验证正确的重组子为模板扩增LC3基因,并构建pUC18-LC3重组质粒,将其转化到E.coli BL21(DE3)中。SDS-PAGE结果表明,菌体诱导后形成包涵体形式的表达产物,以电泳回收目的蛋白并免疫新西兰白兔,获得大鼠LC3蛋白多克隆抗体。western blot结果显示,制备的多克隆抗体可特异性识别LC3蛋白。
- 倪志华张瑞英张玉明周艳芬
- 关键词：原核表达多克隆抗体
- 家蝇Denfensin-1基因的克隆、诱导表达及启动子活性分析被引量：4
- 2013年
- 【目的】鉴定一种新的家蝇Musca domestica防御素基因,并分析其功能。【方法】从家蝇转录组数据库中鉴定了1条新的防御素基因cDNA序列,并将其命名为家蝇防御素1(Md-defensin-1)基因Mdde-1。利用生物信息学网站、软件预测其结构等信息。以实时荧光定量PCR技术研究该基因的表达模式,并且利用基因步移技术获得了启动子序列,同时采取细胞转染技术验证Mdde-1启动子活性。【结果】该序列包含一个276 bp的开放阅读框,编码91个氨基酸残基。推导的氨基酸序列N端包括1个23个氨基酸残基的信号肽和1个28个氨基酸残基的前肽。成熟肽由40个氨基酸残基组成,含有1个典型的CSαβ基序。实时荧光定量PCR结果显示,家蝇2龄幼虫受金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus(G+)刺激后Mdde-1表达明显上调,而大肠杆菌Escherichia coli(G-)刺激后表达下调;Mdde-1在家蝇幼虫受到热激时呈上调表达。为进一步研究其调控机制,克隆了Mdde-1启动子,并证明了该启动子具有活性。【结论】据此认为Mdde-1是一种新的家蝇防御素,并且在免疫革兰氏阳性菌方面发挥重要作用;同时我们首先证明了Mdde-1的启动子具有活性。本研究为进一步研究家蝇防御素的作用机制奠定了基础。
- 卢丹郑立王欣欣王凡唐婷柳峰松
- 关键词：家蝇先天免疫抗菌肽防御素启动子
