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嗜热踝节菌脂肪酶(TTL)的重组表达及催化合成普瑞巴林手性中间体: 2016年; 以催化合成普瑞巴林中间体（3 S）-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸为目标,通过基因挖掘得到来源为嗜热踝节菌的脂肪酶氨基酸序列,构建了基因工程菌Escherichia coli BL21/p ET28b-TTL,在16℃成功诱导表达了嗜热踝节菌脂肪酶TTL。分离纯化得到TTL电泳纯酶,其最适反应温度为50℃,在50℃的半衰期为14.5 d,表明TTL具有良好的热稳定性;TTL最适p H为8.0,在p H 7.0-8.5时稳定性好。TTL在50℃、p H 8.0条件下,催化100 mmol/L外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯水解转化率达42%以上,产物的对映体过量值（e.e.值）〉94%。这表明TTL在化学-酶法合成普瑞巴林中具有较大应用潜力。; 吴欣玮郑仁朝郑裕国; 关键词：脂肪酶酶学性质普瑞巴林

摩氏摩根菌产酯酶条件优化及在普瑞巴林手性中间体合成中的应用被引量：3: 2012年; 为建立廉价、高效的普瑞巴林关键手性中间体生产工艺,经单因素优化和正交试验,确定了摩氏摩根菌CCTCC M 2011175最佳产酯酶培养基,组成(g/L)为葡萄糖15.0,牛肉膏7.0,Na2HPO41.0,Fe2(SO4)30.1,吐温-8010.0。优化后酯酶比酶活达到1 071.0 U/L,为出发培养基的2.5倍。以培养基优化后获得的摩氏摩根菌菌体为催化剂,立体选择性拆分外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯水解,转化率达到45%,对映体过量值(e.e.)大于94%,为酶法生产普瑞巴林关键手性中间体奠定了良好基础。; 傅德进郑仁朝郑裕国; 关键词：酯酶普瑞巴林动力学拆分

重组大肠杆菌产疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶分批补料发酵工艺被引量：3: 2015年; 为了获得低成本的疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶(TLL),在5L发酵罐发酵中对工程菌E.coliBL21(DE3)/pET28b-TLL的分批补料发酵工艺进行研究。结果表明:以葡萄糖为碳源的补料培养基,采用溶氧(DO)反馈补料策略进行补料,当OD600=60时降温至28℃,分2次加入终质量浓度为30g/L乳糖进行诱导表达。优化后TLL的表达量提高到798.5U/L,是优化前的2.4倍。本研究为规模化发酵重组菌生产TLL奠定了基础。; 马红叶郑仁朝赵川东郑裕国; 关键词：分批补料发酵大肠杆菌

摩氏摩根菌ZJB-09203酯酶的分离纯化及性质被引量：1: 2014年; 立体选择性水解2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯(CNDE)是化学-酶法合成重大疾病治疗药物普瑞巴林的关键步骤。分离纯化了能够高效水解S-型CNDE的摩氏摩根菌ZJB-09203胞内酯水解酶,并进行酶学性质研究。采用硫酸铵分级沉淀、Phenyl Sepharose 6 FF疏水柱层析、DEAE Sephadex A-50阴离子交换和羟基磷灰石Bio-Scale CHT层析,纯化得到电泳纯的酯水解酶。SDS-PAGE和凝胶过滤HPLC分析确定该酶为单亚基蛋白,分子量为68 kDa。不同碳链长度p-硝基苯酚酯特异性酶解结果表明,该酶为酯酶,酶促合成普瑞巴林手性中间体(S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸的最适pH为9.0,最适温度为45℃,且在pH 7.0-9.0和40℃条件下具有良好的稳定性。Ca2+、Cu2+、Mn2+对酶活有一定的促进作用,Co2+、Fe3+、Ni2+及EDTA对酶活有较强的抑制作用。此外,考察了该酯酶水解p-硝基苯酚酯的动力学参数,及CNDE浓度对转化率的影响。首次报道了能够立体选择性水解CNDE的酯酶,相关酶学性质研究将为该酶催化合成普瑞巴林手性中间体的工业化应用提供重要依据。; 郑仁朝王天真黎小军郑裕国; 关键词：酯酶分离纯化酶学性质

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浙江省重大科技专项基金(2012C03005-2)