中央高校基本科研业务费专项资金(2009PY006)
- 作品数：7 被引量：54H指数：4
- 相关作者：何璟周俊鲁慧囡李华赵裕栋更多>>
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- 相关领域：生物学农业科学轻工技术与工程化学工程更多>>
- 土壤微生物总DNA提取方法的优化被引量：32
- 2012年
- 【目的】土壤中未培养微生物约占总量的99%,这就意味着绝大多数微生物资源还未得到开发和利用。本研究通过优化土壤微生物总DNA的提取方法,获得较高质量的DNA,为后期研究土壤微生物的多样性及构建大插入片段的宏基因组文库奠定基础。【方法】通过综合比较已报道的微生物DNA提取方法的优缺点,我们设计出一种新的提取方案。对提取过程中的几个关键步骤进行了优化,包括联合使用SDS-CTAB和溶菌酶一起来破细胞,利用氯仿除蛋白,使用PVPP柱纯化DNA等。比较分析了优化后的方法和3种已报道方法所获得的土壤总DNA的产量、纯度及片段大小。【结果】优化后的方法所获得的土壤DNA质量明显有所提高:每克土壤最高能提取95μg DNA,A260/A280和A260/A230比值更接近理想水平,PCR扩增能够得到明显的目标条带,DNA片段最大能达到100 kb左右。【结论】通过比较分析,最终确立了一种较理想的土壤微生物总DNA提取方法,为更好地开发利用土壤未培养微生物资源提供了有力工具。
- 赵裕栋周俊何璟
- 关键词：土壤微生物PCR扩增
- Streptomyces sahachiroi ATCC 33158中一个Ⅲ型聚酮合酶基因的克隆及功能分析被引量：2
- 2013年
- 从链霉菌Streptomyces sahachiroi ATCC 33158基因组中克隆到1个聚酮合酶(polyketide synthase,PKS)基因orf18。生物信息学及进化树分析表明它可能属于rppA类Ⅲ型PKS基因。通过RT-PCR证实了该基因在野生型S.sahachiroi中是可以进行转录表达的。HPLC和LC-MS分析的结果表明orf18在S.lividans中异源表达时可产生1,3,6,8-四羟基萘(THN),并且发现该基因也可以在革兰氏阴性菌Pseudomonas stutzeri中异源表达并产生明显的棕红色色素。证明orf18编码的蛋白属于RppA类Ⅲ型PKS,可催化THN的合成,而产物THN在革兰氏阴性菌P.stutzeri中可进一步氧化及聚合形成棕红色色素。
- 强慧玲原海亮何璟
- 关键词：异源表达
- 适用于链霉菌大片段基因组DNA克隆和异源表达的细菌人工染色体(BAC)载体的构建及应用被引量：10
- 2012年
- 【目的】很多链霉菌来源的天然产物的生物合成基因簇往往很大,用传统的cosmid载体很难完整的克隆和异源表达。本研究通过载体改造,成功构建出一个新的细菌人工染色体(BAC)载体,用于链霉菌来源的天然产物生物合成基因簇的克隆及异源表达实验。【方法】从复合型载体pCUGIBAC1出发,通过λRED介导的PCR-targeting方法,用链霉素抗性基因替换掉原有的氯霉素抗性基因标记,同时插入链霉菌中常用的安普拉霉素抗性标记、转移起始位点oriT、φC31整合酶基因int、整合位点attP等元件。【结果】成功构建出可装载链霉菌大片段DNA的BAC载体pMSBBACs。使用pMSBBACs构建出链霉菌U27的基因组BAC文库,平均插入片段大小为100 kb。选取其中一个大小为140 kb的BAC质粒进行功能验证,实验证明通过接合转移和原生质体转化的方法都能够将这个大型BAC质粒导入链霉菌模式菌株,并通过位点特异性重组整合到染色体中进行异源表达。【结论】BAC载体pMSBBACs可成功用于放线菌大片段基因组DNA的克隆和异源表达实验。
- 黄胜李娜周俊何璟
- 关键词：生物合成基因簇链霉菌异源表达
- Streptomyces sahachiroi ATCC 33158中孢子色素合成基因簇(sah)的鉴定
- 2012年
- 【目的】Streptomyces sahachiroi ATCC 33158全基因组测序后,通过生物信息学分析找到一个II型聚酮合酶(polyketide synthase,PKS)基因簇sah。我们通过基因敲除和异源表达的方法对sah的生物学功能进行了研究。【方法和结果】对sah基因簇ORF(open reading frame)进行分析后发现,除了一个额外的氧甲基转移酶基因sahI以外,该基因簇与天蓝色链霉菌中负责孢子色素合成的基因簇whiE具有很高的相似性。将sah中负责后修饰的3个基因sahG、sahH和sahI分别敲除后,发现孢子色素的颜色随之发生明显的变化。将sah-minimal PKS基因和whiE-minimal PKS基因分别导入变铅青链霉菌ZX1中进行异源表达,高效液相色谱及液质联用分析证实它们产生相同的水溶性红色色素物质。【结论】sah与whiE基因簇具有相似的生物学功能,负责链霉菌孢子色素的合成。这两个基因簇所合成的孢子色素具有相同的母核,差别在于sah基因簇中多了一个编码氧甲基转移酶的后修饰基因,这可能是导致两种链霉菌孢子在颜色上有细微差别的原因。
- 李华王利娟何璟
- 关键词：ATCC基因中断异源表达
- 酪蛋白水解物对雷帕霉素产生菌Streptomyces hygroscopicus ATCC29253接合转移效率的影响被引量：6
- 2012年
- 吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)ATCC29253能够产生非常丰富的次级代谢产物,除了雷帕霉素外,还可以分泌尼日利亚菌素、洋橄榄叶素、六烯类抗生素等多种具有生物活性的物质,具有重要的研究价值和应用前景。【目的】而建立高效的遗传操作系统是研究该链霉菌相关代谢产物合成机理和构建基因工程菌株的基础。【方法】我们测试了不同培养基及供体菌对吸水链霉菌及其它链霉菌接合转移效率的影响。【结果】我们发现酪蛋白水解物和镁离子能显著提高S.hygroscopicus ATCC29253接合转移效率。通过随机组合试验,筛选出最佳的MgCl2和酪蛋白水解物浓度组合,使得S.hygroscopicus ATCC29253接合转移效率达到1.5×10-4。同时我们还发现酪蛋白水解物可以明显改变S.lividans、S.albus、S.avermitilis的接合转移效率。【结论】本研究首次发现酪蛋白水解物不光对S.hygroscopicus ATCC29253接合转移有作用,对其它常用的链霉菌如S.lividans、S.albus、S.avermitilis等的接合转移效率都有显著的影响。
- 张万垚鲁慧囡何璟
- 关键词：酪蛋白水解物
- Streptomyces sahachiroi ATCC 33158中Ⅱ型聚酮合酶基因sahA的功能分析被引量：2
- 2013年
- 以酮基合酶基因KSa的简并性引物对Streptomyces sahachiroi基因组进行扩增,发现除了已知的阿嗪霉素B生物合成基因簇以外,还存在一个潜在的聚酮合酶(PKS)基因sahA。对sahA编码的氨基酸序列进行同源性比对及进化树分析,结果表明,sahA属于Ⅱ型聚酮合酶基因家族,与合成孢子色素的基因亲缘关系较近。通过单交换中断sahA基因后,链霉菌孢子的颜色由铅灰色变为白色,而产孢时间、孢子的产量以及其抗紫外线的能力都没有变化,对抗生素阿嗪霉素B的产量也没有影响。初步证实这个潜在的Ⅱ型聚酮合酶基因sahA很可能与S.sahachiroi孢子色素的生物合成有关。
- 李华鲁慧囡何璟
- 关键词：STREPTOMYCESATCC
- 吸水链霉菌ATCC 29253产Hygrocins的条件优化被引量：4
- 2011年
- 吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)ATCC29253能够产生多种具有较好生物活性的次级代谢产物,包括雷帕霉素、尼日利亚菌素、洋橄榄叶素、安莎类抗生素Hygrocins等。通过改变发酵的温度、pH及通氧量,探索菌丝体的最佳生长条件。利用正交试验优化改变培养基中各组分的含量,测试了不同的碳源和氮源对发酵的影响。优化后的培养基组成为甘油20.0 mL/L,棉子饼粉30.0 g/L,磷酸二氢钾1.0 g/L,磷酸氢二钾1.5 g/L,氯化钠5.0 g/L,甘露醇20.0 g/L,水解酪蛋白5.0 g/L。优化的发酵培养基不仅明显提高了hygrocins的产量,同时还较大幅度地促进了雷帕霉素的产生。
- 吴竹华王明艳何璟
- 关键词：雷帕霉素正交试验发酵培养基
