重庆市自然科学基金(CSTC2010BB5097)
- 作品数：2 被引量：6H指数：2
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- 相关机构：重庆医科大学更多>>
- 发文基金：重庆市自然科学基金中国博士后科学基金国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 显性负性突变体对AP2α转录因子及其活性的影响被引量：4
- 2011年
- 转录蛋白2α(activator protein-2α,AP2α)的转录活性可能是全反式视黄酸(all-trans-retinoic acid,ATRA)促进骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)神经分化的关键调控点,但具体机制尚不清楚,显性负性突变是研究基因功能的一个经典手段.以携带AP2α全长基因的pAd-AP2α质粒为模板,分别扩增缺失bHLH及缺失TAD区域的AP2α片段,采用AdEasy腺病毒包装系统获得两种AP2α缺失型显性负性突变体重组腺病毒Ad-dnAP2α-△bHLH及Ad-dnAP2α-△TAD,腺病毒感染ATRA诱导24 h的大鼠MSCs可观察到60%以上RFP阳性细胞.Real-time-PCR、Western blot及免疫荧光结果显示AP2α定位于MSCs细胞核,经A-TRA诱导24 h,AP2α的表达无变化,而其下游基因bcl-2及c-kit表达增高,两种缺失型显性负性突变体腺病毒感染MSCs对野生型AP2α的mRNA及蛋白表达没有影响,却能有效抑制AP2α对下游靶基因bcl-2和c-kit的转录激活作用.为进一步研究AP2α转录活性在ATRA诱导MSCs成神经分化中的作用提供重要的分子手段.
- 毕杨何昀龚敏张赟陈洁李廷玉
- 关键词：腺病毒骨髓间充质干细胞
- 腺病毒介导siRNA抑制ATRA诱导的骨髓间充质干细胞RARβ表达
- 目的：构建携带针对大鼠RARβ基因的siRNA重组腺病毒,并感染ATRA处理的骨髓间充质干细胞(MSCs),检测RARβ的表达,为进一步研究维甲酸信号转导通路在MSCs成神经分化中的作用机制奠定重要基础.方法：设计针对大...
- 毕杨龚敏何昀张赟陈洁李廷玉
- 关键词：腺病毒MSCS
- 腺病毒介导siRNA抑制全反式维甲酸诱导的骨髓间充质干细胞RARβ表达被引量：2
- 2012年
- 构建携带针对大鼠维甲酸受体β(Retinoic acid receptorβ,RARβ)基因的siRNA重组腺病毒,并感染全反式维甲酸(All-trans retinoic acid,ATRA)处理的骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs),检测其对RARβ的表达及MSCs成神经分化的影响。设计针对大鼠RARβ的4对siRNA的DNA序列,体外退火形成双链,定向克隆至含有U6/H1双启动子的腺病毒穿梭质粒pSES-HUS,随后与腺病毒骨架质粒pAd-Easy1在BJ5183细菌中同源重组,并在HEK293细胞中包装获得重组腺病毒Ad-siRARβ。腺病毒感染大鼠MSCs后经ATRA处理24 h,Real-time、Western blotting及免疫荧光检测RARβ的表达情况。改良神经诱导培养基(Modified neuronal induction medium,MNM)诱导MSCs神经分化,Real-time PCR及免疫荧光检测神经相关蛋白表达。PCR、酶切及测序鉴定均证实siRNA正确克隆至腺病毒质粒中,腺病毒感染大鼠MSCs后可观察到60%以上的细胞有红色荧光蛋白(Red fluorescent protein,RFP)表达。经ATRA处理24 h,Real-time、Westernblotting及免疫荧光检测发现RARβ表达定位于细胞核,ATRA作用后MSCs中RARβ表达增高16.5±2.34倍(P<0.05),有3组siRNA能有效抑制ATRA诱导的RARβ表达增强,抑制率分别为(66.26±9.12)%、(48.70±5.78)%、(64.09±0.53)%(P<0.05),且以pool组效果最强,抑制率为(78.09±4.24)%(P<0.01)。ATRA联合MNM诱导MSCs成神经样细胞,表达相关神经特异蛋白Nestin、NSE、MAP-2、Tau,免疫荧光结果显示神经标志蛋白Nestin、NSE、Tju1表达阳性细胞率为(50-88)%,而腺病毒介导的siRARβ能有效抑制MSCs的神经标志物表达水平及阳性细胞率(P<0.05)。成功构建了携带针对大鼠RARβ基因的siRNA重组腺病毒,能有效感染MSCs并显著抑制ATRA诱导的RARβ表达增强和MSCs的神经分化。
- 毕杨龚敏何昀张赟陈洁李廷玉
- 关键词：腺病毒载体骨髓间充质干细胞
