国家自然科学基金(30572076)
- 作品数：7 被引量：38H指数：3
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- 蛋白激酶A催化微管相关蛋白tau磷酸化的研究被引量：3
- 2006年
- 目的:研究蛋白激酶A(PKA)对微管相关蛋白tau的磷酸化作用。方法:采用免疫印迹技术,利用位点特异性、磷酸化依赖的tau蛋白抗体,检测PKA对tau蛋白磷酸化作用的位点特异性及磷酸化作用动力学。用双倒数作图,计算PKA催化tau磷酸化以及各个位点磷酸化的Km值,并结合培养细胞的实验,研究PKA对tau蛋白磷酸化作用的位点特异性。结果:PKA催化tau蛋白在Ser214,Ser262,Ser409三个位点磷酸化,而且各位点磷酸化作用的Km值不同,PKA对Ser214的Km值最低,即对Ser214位点的亲和性最高,催化其磷酸化的能力最强。在细胞实验中,也显示了PKA引起Ser214位点的磷酸化最明显。结论:PKA催化tau蛋白在Ser214,Ser262,Ser409三个位点磷酸化,其中Ser214是PKA催化tau磷酸化反应的最好位点。
- 施建华钱慰丁绍红尹晓敏沈勤刘飞
- 关键词：TAU蛋白激酶A磷酸化
- 剪接因子SRp55原核表达质粒的构建和表达被引量：1
- 2007年
- 目的:本研究通过扩增剪接因子SR蛋白家族的SRp55基因,构建GST融合蛋白原核表达质粒pGEX-2T/SRp55,并在大肠杆菌中诱导表达并进行纯化。方法:用PCR法扩增SRp55基因,将扩增产物和载体pGEX-2T进行双酶切后回收,连接载体和目的片段,获得重组质粒。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)。在大肠杆菌BL21(DE3)中通过IPTG进行诱导表达,然后用谷胱甘肽-琼脂糖球珠,亲和纯化得到纯的GST-SRp55融合蛋白。结果:SRp55基因以正确的阅读框架插入pGEX-2T。IPTG诱导大肠杆菌BL21(DE3)表达,随诱导时间的增加蛋白表达量增高,4h以后接近最高表达量。通过亲和纯化得到分子量在60kD左右的蛋白,经蛋白印迹分析证实为GST-SRp55融合蛋白。结论:成功地构建了GST融合蛋白原核表达质粒pGEX-2T/SRp55,并获得GST-SRp55融合蛋白,为进一步研究tau蛋白可变剪接机制提供了必要的基础。
- 尹晓敏施建华刘飞
- 关键词：TAU原核表达剪接因子
- 高脂饲料诱导的胰岛素抵抗大鼠骨骼肌己糖胺通路流量的变化被引量：1
- 2010年
- 目的探讨己糖胺通路（HBP）在高脂饲料诱导胰岛素抵抗形成中的作用。方法雄性sD大鼠随机分为3组：对照组、高脂组和罗格列酮组。13周后，检测大鼠血清甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、游离脂肪酸（FFA）、骨骼肌中TG和FFA的含量，胰岛素敏感性采用胰岛素敏感指数（ISI）和高胰岛素正糖钳夹试验稳态时的葡萄糖输注率（GIR）来评估，骨骼肌HBP的流量用谷氨酰胺：6-磷酸果糖转氨酶（GFAT）mRNA的表达水平、二磷酸尿嘧啶-N-乙酰葡萄糖胺（UDP—GlcNAc）的含量及蛋白O—GlcNAc糖基化水平来衡量。结果高脂组大鼠与对照组相比，血清TG、TC、FFA以及骨骼肌TG、FFA均升高（均P〈0．01）；ISI、GIR均降低（均P〈0．01），骨骼肌GFATmRNA的表达（0．51±0．05对0．18±0．02）、UDP—GlcNAc含量[（6．18±0．86对2．42±0．36）nmol／g]以及蛋白O—GlcNAc糖基化水平均明显升高（均P〈0．01）。罗格列酮组大鼠与高脂组相比，血清和骨骼肌TG、FFA明显降低（均P〈0．01），胰岛素敏感性提高（P〈0．05），GFATmRNA的表达（0．27±0．03）、UDP—GlcNAc含量[（2．62±0．32）nmol／g]以及蛋白O—GlcNAc糖基化水平均明显降低（均P〈0．05）。结论高脂饲料诱导大鼠胰岛素抵抗与其增加骨骼肌HBP的流量相关，可被罗格列酮降低。
- 顾锦华施建华朱清周虹徐济良
- 关键词：胰岛素抵抗高脂饲料罗格列酮
- 糖元合成酶激酶3β对微管相关蛋白tau的磷酸化作用被引量：13
- 2007年
- tau蛋白是中枢神经系统中重要的微管相关蛋白,其功能受磷酸化调节.异常过度磷酸化的tau蛋白是阿尔茨海默病患者脑中神经纤维缠结的主要组成部分.糖元合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)是重要的tau蛋白激酶之一,它虽可催化tau蛋白多个位点的磷酸化,但对不同位点,其催化效率不同.通过位点特异性、磷酸化依赖的tau蛋白抗体,用免疫印迹技术,检测GSK-3β对tau蛋白位点特异性的磷酸化作用及动力学.用双倒数作图,计算GSK-3β催化tau磷酸化以及各个位点磷酸化的Km值,并结合培养细胞中的实验,研究GSK-3β对tau蛋白磷酸化作用的位点特异性.结果显示,GSK-3β催化tau蛋白多个位点的磷酸化,其中包括Thr181、Ser199、Ser202、Thr205、Thr212、Thr217、Thr231、Ser396和Ser404,对不同的位点磷酸化作用,其Km值不同,GSK-3β对Ser396的Km值最低,即对Ser396位点的亲和性最高,催化其磷酸化的能力最强.在培养的细胞中,也显示了GSK-3β的表达引起Ser396位点的磷酸化最明显.
- 刘飞施建华丁绍红尹晓敏
- 关键词：TAU磷酸化
- O-GlcNAc糖基转移酶表达下调对tau蛋白磷酸化的影响
- 2008年
- 目的:以人O-GlcNAc糖基转移酶(OGT)基因为靶点,研究小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)对HEK293T细胞中OGT基因表达的抑制作用,以及这种抑制作用对tau蛋白磷酸化与糖基化修饰的影响。方法:根据人OGT基因序列特点,设计高效且特异性强的siRNA。用脂质体转染siRNA进入HEK293T细胞,通过实时PCR检测siRNA对OGT基因表达的抑制。用蛋白免疫印迹法检测tau蛋白糖基化与磷酸化修饰的变化。结果:设计的siRNA能够有效抑制OGT基因的表达,与空白组相比,抑制效率可达78.1%左右。OGT基因表达的下调使tau蛋白糖基化水平下降,而磷酸化水平增高。结论:tau蛋白的糖基化负调节其磷酸化,葡萄糖摄入减少或代谢降低可能在阿尔茨海默尔病的发生发展中起关键作用。
- 杨江勇施建华沈勤
- 关键词：TAU蛋白RNA干扰
- RNAi抑制OGT基因表达对tau蛋白糖基化与磷酸化修饰的影响
- 本实验拟通过RNA干扰的方法降低HEK293T细胞内OGT基因的表达水平，检测tau蛋白多个位点磷酸化与糖基化的变化，为揭示阿尔茨海默病(AD)发病机制提供实验依据。
- 杨江勇沈勤
- 关键词：基因表达
- O-GlcNAc糖基转移酶(OGT)基因表达的抑制对tau蛋白磷酸化作用的影响被引量：7
- 2009年
- 研究HEK293T细胞中O-GlcNAc糖基转移酶(OGT)基因表达抑制对与AD密切相关的tau蛋白磷酸化与糖基化修饰的影响.以OGT基因为靶点设计三段siRNA(OGT-siRNA1～3),用脂质体的方法转染OGT-siRNA1～3进入HEK293T细胞,通过RT-PCR检测OGT-siRNA1～3对OGT mRNA的抑制.将pEGFP/OGT与OGT-siRNA1～3共转染HEK293T细胞,24h后在倒置荧光显微镜下观察各组GFP/OGT的表达,根据GFP/OGT的表达量来评价OGT-siRNA1～3对OGT基因表达的抑制率.将筛选出的具有最佳沉默效果的OGT-siRNA与质粒pCI/tau441共转染HEK293T细胞,48h后Western blot检测tau蛋白糖基化与磷酸化修饰的变化.OGT-siRNA3在100nmol/L的终浓度时对OGT基因的抑制效率最高.与Mock组相比,对OGT基因mRNA及蛋白质水平的抑制率分别可达80.0%与51.3%左右.OGT基因表达的下调使tau蛋白糖基化水平下降,而磷酸化水平增高,证实tau蛋白的糖基化负调节其磷酸化,葡萄糖摄入减少或代谢降低可能在AD的发生发展中起关键作用.
- 杨江勇顾建兰施建华刘飞沈勤
- 关键词：阿尔茨海默病TAU蛋白RNA干扰
- PKA、GSK-3β和cdk5对微管相关蛋白tau的位点特异性磷酸化被引量：19
- 2006年
- 目的:研究cAMP依赖的蛋白激酶(cAMPdependentproteinkinase,PKA)、糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)和细胞周期依赖性蛋白激酶5(cyclin-dependentkinase5,cdk5)在体外和培养的细胞中对tau蛋白位点特异性磷酸化的调节作用。方法:以人最长的异构体tau441作为底物,通过蛋白质印迹分析,观察以上3种酶对tau蛋白位点特异性磷酸化的调节作用。结果:PKA在体外能够磷酸化Ser214、Ser262、Ser409,但在培养的细胞中,PKA的激活仅使得tau蛋白在Ser214位点的磷酸化增加,而不能磷酸化Ser262和Ser409。在体外和培养的细胞中,GSK-3β和cdk5均能磷酸化tau蛋白许多位点,包括Thr181、Ser199、Ser202、Thr205、Thr212、Thr217、Ser396、Ser404,使得tau蛋白的迁移减慢。结论:在培养的细胞中,PKA的激活使得tau蛋白在Ser214位点的磷酸化增加。GSK-3β能更好地磷酸化tau蛋白微管结合域下游的磷酸化位点,而cdk5则更容易磷酸化其上游的位点。
- 丁绍红施建华尹晓敏龚成新刘飞
- 关键词：TAU蛋白激酶
